Дифференциальная экспрессия генов в процессе развития
Один из главных и общепризнанных догматов современной эмбриологии состоит в том, что, за исключением нескольких особых случаев, все клетки данного организма, независимо от того какими они становятся в дифференцированном состоянии, содержат в геноме одну и ту же ДНК. Тем не менее экспрессия генов в клетках одного типа явно отличается от их экспрессии в клетках другого типа. Дифференцированные клетки каждого типа обладают свойственной им одним морфологией и поддерживают свой собственный набор синтезируемых белков. Содержащиеся в клетках разного типа матричные РНК (мРНК) также неидентичны. На основе всех этих данных ученые пришли к единодушному мнению, высказанному, например, в 1976 г. Дэвидсоном (Davidson), что дифференцировка обусловливается изменениями дифференциальной экспрессии генов в различных клеточных линиях развивающегося зародыша.
У бактерий экспрессия генов контролируется исключительно регуляторными механизмами, действующими на уровне транскрипции генов, т.е. синтеза мРНК. У эукариот регуляция действия генов более сложная. Регуляция происходит на уровнях транскрипции, процессинга, в результате которого в ядре из большого и сложного первичного РНК-транскрипта образуется соответствующая мРНК, а также на уровне транспорта мРНК из ядра в цитоплазму. Трансляция мРНК после того, как она попадет в цитоплазму, также регулируется разнообразными механизмами. Мы пользуемся достаточно неопределенным термином «генная экспрессия», имея в виду множественность регулирующих механизмов, которые могут здесь действовать.
Начальная детерминированность бластомеров к дифференцировке в определенных направлениях обеспечивается взаимодействием ядерного генома с информацией, находящейся в цитоплазме. Эту гипотезу впервые четко сформулировал Т. Морган (Т. Morgan) в 1934 г. в своей книге «Эмбриология и генетика»:
«Известно, что протоплазма в разных участках яйца несколько различна и что эти различия выявляются более четко в процессе дробления - благодаря происходящему при этом перемещению материалов. Протоплазма поставляет материалы, необходимые для увеличения количества хроматина и для синтеза веществ, вырабатываемых генами. Можно предполагать, что первоначальные различия между участками протоплазмы оказывают влияние на активность генов. Затем гены в свою очередь воздействуют на протоплазму, что приводит к возникновению новой последовательности реципрокных реакций. Такой нам представляется картина постепенного усложнения и дифференцировки различных участков зародыша ».
Информационные элементы гипотетического зародыша схематически представлены на рис. 4-3, на котором изображен срез оплодотворенного яйца, содержащего ядро и локализованные цитоплазматические макромолекулы двух типов, показанные мелкими и крупными точками. Цитоскелетный матрикс яйца изображен в виде решетки. Следует указать, что решетка - это просто статичное изображение цитоскелетной системы, которая сама, по-видимому, изменяется с течением развития. После того как началось дробление, каждая клетка зародыша получает ядро, равноценное по содержанию ДНК каждому из других ядер, однако эти ядра оказываются в разном цитоплазматическом окружении. Стрелками на рис. 4-3 показаны потоки информации. Таким образом каждое из ядер, находящихся в различных бластомерах, получает особый сигнал от определенных локализованных макромолекул. Ответ ядра на полученный сигнал зависит от вида макромолекул, локализованных в данном бластомере. Это взаимодействие приводит к инициации ядрами специфичных типов генной экспрессии (изображенной стрелками, выходящими из ядер). Избирательная транскрипция, процессинг и трансляция специфичных частей ядерного генома ведет к биохимической и морфологической дифференцировке клеток зародыша. Еще одно важное взаимодействие изображено стрелками, идущими от одной клетки к другой; это пример индукционного взаимодействия, возникающего между группами клеток зародыша, при котором какое-то вещество, вырабатываемое одной группой клеток, индуцирует в определенное время специфическую дифференцировку другой группы клеток. У хордовых, например, хорда индуцирует дифференцировку вышележащей эктодермы в нервную ткань.
Рис. 4-3. Регионализованные информационные системы яиц и зародышей. Цитоскелет изображен в виде решетки, ядра черные, а регионализованные детерминанты морфогенеза показаны мелкими и крупными точками. Стрелками изображен поток информации. Эта модель чересчур статична, потому что в большинстве случаев детерминанты морфогенеза не бывают локализованы заранее, но перемещаются к своим конечным местоположениям в ходе нескольких первых дроблений (Raff, 1977; с изменениями).
Убедительные примеры локализованности информации, приводящей к специфичной экспрессии генов в разных участках клетки, встречаются редко, однако мы опишем один такой превосходный пример. Примитивные родичи хордовых - асцидии - во взрослом состоянии не особенно примечательны: это мешковидные сидячие формы, по способу питания относящиеся к фильтраторам. Однако личинки большинства видов асцидии не только подвижны, но и обладают неожиданной и интересной морфологией. Строение этих головастикообразных личинок, как показано на рис. 4-4, соответствует основному плану строения тела, типичному для хордовых, т.е. у них имеется спинной нервный тяж и хорда, или примитивный позвоночник. В туловище заключены зачатки половозрелой асцидии, но единственные функциональные эмбриональные структуры туловища - это три сосочка прикрепления на переднем конце тела, сенсорный пузырек, содержащий одноклеточный отолит, и глазок, в котором имеются три клетки хрусталика, пигмент и десяток ретинальных клеток. Эти сенсорные структуры дают личинке возможность ориентироваться по отношению к направлению силы тяжести и к источнику света. Подвижный хвост содержит хорду, состоящую из 40-42 вакуолизированных клеток. Над хордой лежит нервная трубка, а по обе стороны от нее - тяжи, состоящие из поперечнополосатых мышечных клеток, по 18 в каждом тяже. Вся личинка одета оболочкой из эпидермальных клеток. Личинка не питается; она плавает в течение всего нескольких часов, после чего находит себе подходящий субстрат, прикрепляется и претерпевает метаморфоз, превращаясь во взрослую особь, которая ведет сидячий образ жизни и добывает себе пищу путем фильтрации воды.
Рис. 4-4. Головастикоподобная личинка асцидий и ее метаморфоз. А. Свободно плавающая личинка. Б. Личинка, прикрепившаяся к субстрату и начавшая метаморфоз. В. Завершение метаморфоза, сопровождающееся утратой подвижности и сенсорных структур (Korschelt, Heider, 1900).
В 1973 г. Уиттейкер (R. Whittaker) опубликовал исследование по регуляции появления у асцидии Ciona двух ферментов, место синтеза которых в зародыше было установлено. Это ацетилхолинэстераза, появляющаяся только в мышечных клетках на стадии хвостовой почки, и тирозиназа, появляющаяся на этой же стадии только в двух пигментных клетках нервного узла. Подавляя дробление в разные сроки, Уиттейкер получал зародыши, прекратившие развитие на стадии 2, 4, 8, 16 или 32 клеток (нормальный зародыш к моменту появления двух названных ферментов, т. е. спустя 9-12 ч после оплодотворения, состоит примерно из 1000 клеток). Зародыши, дробление которых было прекращено, оставались живыми и синтезировали тирозиназу и ацетилхолинэстеразу в то же самое время, что и нормальные зародыши. Самый важный результат этих экспериментов состоял в том, что синтез ферментов у зародышей с подавленным дроблением был пространственно локализован. Если дробление приостанавливали на стадии двух бластомеров, то оба они синтезировали ацетилхолинэстеразу, но при остановке развития на более поздних стадиях дробления синтез ее все более ограничивался клетками, из которых в норме образуется хвостовая мышца. Уиттейкер пришел к выводу, что способность к синтезу тирозиназы и ацетилхолинэстеразы локализуется в определенных участках цитоплазмы на ранних стадиях развития. Этот вывод подтвердили результаты более поздней работы того же автора, в которой он и его сотрудники хирургическим путем удаляли у 8-клеточных зародышей Ciona ту пару бластомеров, из которых развиваются мышцы. Затем эти клетки помещали в морскую воду, где они синтезировали ацетилхолинэстеразу, тогда как в остальных клетках зародыша этот фермент не синтезировался.
Пуромицин - один из ингибиторов белкового синтеза - препятствовал появлению тирозиназы и ацетилхолинэстеразы, и это доказывает, что молекулы фермента действительно синтезируются в то самое время, когда выявляется ферментная активность. Далее, обработка актиномицином D, подавляющим синтез РНК, также препятствовала появлению ферментов, если ее производили за 2 ч до появления ферментативной активности. Эти результаты позволяют считать, что мРНК, необходимые для синтеза этих ферментов, не запасаются заранее, а продуцируются незадолго до синтеза. Регионально-специфичный синтез мРНК - результат действия макромолекул, локализованных в определенных участках цитоплазмы, как это показано на рис. 4-3.
Описанные здесь эксперименты можно было бы, вероятно, подвергнуть критике на том основании, что актиномицин подавляет синтез фермента, отравляя клетки каким-то неспецифическим образом. Однако другая серия экспериментов, проведенных Уиттейкером на другом ферменте, который появляется только в энтодерме личинки, а именно на щелочной фосфатазе, показала, что это не так: появление этого фермента не подавляется актиномицином. Необходимая для синтеза щелочной фосфатазы мРНК, по-видимому, уже содержится в яйце и в ходе развития сама становится все более локализованной.
С такой локализацией информационных детерминантов, определяющих появление ацетилхолинэстеразы у личинок оболочников, связано одно интересное и поучительное явление. Уиттейкер изучал также некоторые виды оболочников, относящихся к роду Mogula , у которых личинки не развиваются до головастикоподобной стадии. У одного из них, М. arenata, несмотря на то что у него не образуется ни хвостовых мышечных клеток, ни даже самого хвоста, происходит локальный синтез ацетилхолинэстеразы в том участке зародыша, где должны были бы находиться мышечные клетки хвоста. Итак, несмотря на утрату способности к морфогенезу хвоста, локализованные детерминанты синтеза ацетилхолинэстеразы сохранились. У некоторых других (возможно, более древних) видов Mogula , у которых личинки также лишены хвостов, способность синтезировать этот фермент утрачена. Важное значение несопряженности клеточной дифференцировки, о которой можно судить по синтезу ферментов или других белков, с морфогенезом как механизмом эволюции рассматривается более подробно в гл. 5.
Работы Уиттейкера по оболочникам вскрывают два важных аспекта этой проблемы: 1) дифференциальная экспрессия генов, обусловленная действием локализованных в определенных участках детерминантов, играет решающую роль в дифференцировке; 2) существует, по-видимому, несколько механизмов, обеспечивающих хранение и экспрессию локализованной морфогенетической информации.
Зародыши активно синтезируют белки, используя мРНК-матрицы, происходящие из двух источников: мРНК одного класса синтезируются в процессе оогенеза и хранятся в яйце до тех пор, пока не используются в процессе развития; мРНК другого класса синтезируются в результате транскрипции, происходящей в ядрах самого зародыша. мРНК обоих классов содержат большое число последовательностей и транслируются на ранних стадиях развития. Для того чтобы представить себе количество мРНК, синтезируемой при оогенезе, и степень ее разнообразия (ее сложность), следует понаблюдать, до какого уровня может дойти развитие зародышей морского ежа, если блокировать транскрипцию в их клетках. Такие зародыши достигают стадии бластулы, что требует значительного уровня морфогенетической активности, в том числе клеточных делений, изменений формы клеток, сборки ресничек и синтеза фермента вылупления. Если блокировать транскрипцию в клетках зародыша, то гаструляции не происходит. Дифференцировка на более поздних стадиях, чем бластула, в значительной степени зависит от действия генов данного зародыша.
Галау (Galau) и его соавторы изучали вопрос о числе структурных генов, которые должны экспрессироваться в процессе развития зародышей морского ежа. По мнению этих исследователей, величина набора генов, которые должны экспрессироваться в клетках одного типа, чтобы отдифференцировать их от клеток другого типа в том же организме, еще не установлена. Неизвестно также, какое число генов необходимо для обеспечения основных жизненных функций («housekeeping»), общих для всех клеток. Используя метод гибридизации нуклеиновых кислот, Галау и др. определяли число структурных генов, представленных в виде активной мРНК на разных стадиях зародышевого развития и в различных тканях взрослого организма. Далее они определяли, какая доля конкретных генов, представленных в мРНК гаструлы, была представлена также в мРНК других изучавшихся ими стадий и тканей. Оказалось, что во время развития очень большое число генов экспрессируется в виде мРНК. Например, на стадии гаструлы в процессе трансляции в белки находятся мРНК, представляющие от 10 до 15 тысяч генов. Большое число структурных генов экспрессируется аналогичным образом на других стадиях развития и в тканях взрослого организма. Некоторые из них являются общими для всех изученных стадий и тканей, но большинство экспрессируется лишь на отдельных стадиях и в определенных тканях. Авторы данной работы пришли к выводу, что эти глубокие различия между разными стадиями развития или разными тканями в отношении экспрессии генов лежат в основе их функциональной дифференцировки. Таким образом, в дифференцировке, происходящей в процессе развития, участвует дифференциальная экспрессия тысяч генов в виде мРНК, и эта экспрессия сопровождается изменением состава мРНК, синтезируемых ядрами клеток, претерпевающих дифференцировку.
Если дифференциальное действие генов должно вызываться факторами, локализованными в цитоплазме, то должны существовать доказательства в пользу того, что компоненты цитоплазмы действительно способны направлять функцию ядра. Такие доказательства получены в экспериментах по трансплантации ядра из клетки одного типа в клетку какого-либо другого типа. Ярким примером такого подхода служат эксперименты по введению ядер клеток головного мозга взрослой лягушки в лягушачьи клетки-реципиенты трех типов, проведенные Грэхемом с сотрудниками (Gracham et al.) и Гёрдоном (J. Gurdon) в лаборатории последнего. Ядра из клеток головного мозга взрослой лягушки обычно не синтезируют ДНК и не претерпевают митоза. Эти ядра вводили:
1) в незрелые ооциты, синтезирующие РНК, но не ДНК; 2) в овулировавшие ооциты, завершающие мейоз и содержащие уплотненные хромосомы на веретенах мейоза; 3) в яйцеклетки сразу после активации, синтезирующие ДНК, но не РНК. Во всех случаях введенные ядра изменяли свою активность, так чтобы она соответствовала характеристикам клеток-реципиентов. Так, например, в ядрах, введенных в созревающие ооциты, хромосомы уплотнялись и ассоциировались с веретенами, а в ядрах, введенных в активированные яйца, начинался синтез ДНК. Поскольку ни та ни другая активность несвойственны ядрам клеток мозга, эти новые активности, очевидно, вызывались цитоплазмой клеток-реципиентов. Сходные эксперименты по пересадке ядер показали также, что транскрипция определенных генов в пересаженных ядрах (а именно, генов рибосомной РНК) регулируется цитоплазмой клетки-хозяина.
Влияние цитоплазмы на ядро достигает такой степени, что оно определяет специфические типы синтеза мРНК. Де Робертис и Гёрдон (De Robertis и Gurdon) вводили ядра клеток шпорцевой лягушки (Xenopus), выращивавшихся в культуре ткани, в ооциты тритона Pleuradeles. Используя высокое разрешение с помощью двумерного гель-электрофореза, они могли отличать синтез белков, характерных для Xenopus, от белков, характерных для культивируемых клеток Pleurodeles, а также синтеза белков, характерных для культивируемых клеток Xenopus, от белков, характерных для ее ооцитов. При пересадке ядер из культивируемых клеток Xenopus в ооциты Pleurodeles в них начинали синтезироваться белки, свойственные ооцитам Xenopus, но не культивируемым клеткам. Эти изменения состава синтезируемых белков можно было предотвратить при помощи?-аманитина - вещества, подавляющего синтез РНК. Таким образом, воздействие цитоплазматической среды ооцитов Pseudourodeles на ядра Xenopus заключалось в инактивации экспрессии одного набора генов и активации экспрессии другого набора, характерного для ооцитов.
Цитоплазма оказывает свое регулирующее действие на ядерную активность, скорее всего, на уровне транскрипции; известны случаи специфической транскрипции генов при дифференцировке. Один такой пример связан с кольцами Бальбиани в политенных хромосомах двукрылых. У мух и других двукрылых клетки некоторых тканей (слюнные железы, мальпигиевы сосуды, средняя кишка) содержат гигантские политенные хромосомы, в которых при окраске на ДНК выявляются четко выраженные поперечные полосы (диски). Показано, что многие отдельные полосы соответствуют местоположению отдельных генов и что можно установить корреляцию между генетической картой, с одной стороны, и характером и относительным физическим расположением полос, с другой. В некоторых дифференцированных клетках ограниченное число определенных полос образуют вздутия, выступающие за пределы хромосомы (пуфы). Особенно большие пуфы - кольца Бальбиани возникают в тех участках, в которых находятся гены, необычайно активные в отношении транскрипции. Кольца Бальбиани обладают четырьмя важными свойствами.
1. Клетки разного типа содержат разные кольца Бальбиани. Так, в слюнных железах двукрылого Acricotopus имеются клетки трех типов, которые все содержат одни и те же три гигантские хромосомы, но хромосомы из разных клеток различаются по характеру пуфов и их распределению.
2. Изменения, происходящие в клетках некоторых типов в процессе развития, коррелируют с изменениями в характере пуфов. У некоторых мух гигантские клетки подушечек на лапках в процессе развития претерпевают сложные изменения, сопровождающиеся упорядоченными последовательными изменениями пуфов политенных хромосом.
3. Кольца Бальбиани в политенных хромосомах служат местами активной транскрипции. Дэйнхолту (Daneholt) удалось изолировать единственную в своем роде высокомолекулярную РНК, транскрибированную в одном из колец Бальбиани мотыля Chironomus.
4. Существует прямая корреляция между наличием данного кольца Бальбиани и синтезом определенного белка. Гроссбах (Grossbach) изучал два близкородственных вида: Chironomus tentans и С. pallidivittatus, слюнные железы которых вырабатывают большие количества секреторных белков. В слюнных железах С. tentans синтезируется пять белков, а в железах С. pallidivittatus - те же пять белков и еще один. Синтез этого шестого белка коррелирует с наличием в 4-й хромосоме С. pallidivittatus определенного пуфа, отсутствующего у С. tentans. Скрещивая эти два вида и изучая полученные гибриды, Гроссбах показал, что синтез шестого белка у гибридов зависит от наличия у них 4-й хромосомы С. pallidivittatus с этим особым пуфом.
До недавнего времени такого рода данные рассматривали как доказательство того, что дифференциальная экспрессия генов в процессе развития обусловлена главным образом дифференциальной транскрипцией генов, как это ясно видно в случае колец Бальбиани. Однако некоторые недавние наблюдения заставили отнестись к этому заключению с некоторой осторожностью, поскольку может оказаться, что столь же важную роль играет регуляция экспрессии генов и на других уровнях.
Сложность или число различных уникальных последовательностей ДНК, представленных в виде РНК, обычно в 5-10 раз выше в ядерной РНК, чем в мРНК. Ядерные РНК, представляющие собой непосредственные продукты транскрипции, длиннее, чем мРНК, и содержат предшественники последних. Простая модель дифференциальной транскрипции требует, чтобы две стадии развития с сильно различающимися популяциями матричных РНК, подобные тем, которые изучал Галау, существенно различались и по своим ядерным РНК. Клин и Хамфри (Kleene, Humphreys) сравнивали ядерные РНК, имеющиеся у морского ежа на двух разных стадиях развития, и столкнулись с неожиданностью: число уникальных последовательностей ДНК, транскрибируемых в ядерные РНК, было очень велико (транскрибировалась примерно треть всех этих последовательностей), а последовательности ядерных РНК, присутствующие на этих двух стадиях, были идентичны. Такое сходство между ядерными РНК наблюдается на всех стадиях жизненного цикла. Уолд и др. (Wold et al.) отмечают, что лишь немногие из последовательностей мРНК, транслируемых в белки у зародышей морского ежа на стадии бластулы, присутствуют также в цитоплазме клеток взрослых особей, тогда как в ядрах эти же последовательности содержатся как у зародышей, так и у взрослых особей. Создается впечатление, что в ядрах на всех стадиях развития транскрибируется одно и то же очень большое число структурных генов, но что лишь определенные подмножества этих транскриптов подвергаются процессингу с образованием специфичных мРНК, транслируемых на каждой отдельной стадии.
Наличие транскрипционных, а также посттранскрипционных механизмов, регулирующих дифференциальную экспрессию генов, определяемую ядром, в конечном итоге затрудняет понимание факторов, регулирующих действие генов, однако существование этих механизмов не меняет вытекающий из всего нашего обсуждения основной эмбриологический вывод. Суть гипотезы, схематически изображенной на рис. 4-3, состоит в том, что определенные макромолекулы, локализованные в цитоплазме и распределенные по некоторым бластомерам зародыша, вызывают в этих бластомерах специфичную экспрессию генов, определяемую ядром.
Из книги Собаки. Новый взгляд на происхождение, поведение и эволюцию собак автора Коппингер ЛорнаДифференциальная выживаемость необходима для видообразования Еще один принцип эволюционного видообразования путем искусственного или естественного отбора - дифференциальная выживаемость. При искусственном отборе это означает, что селекционер одним животным дает
Из книги Разведение собак автора Хармар Хиллери Из книги Лечение собак: Справочник ветеринара автора Аркадьева-Берлин Ника ГермановнаДифференциальная диагностика, прогноз и лечение пороков сердца Шумы, возникающие при пороках сердца, имеют особое значение для установления диагноза.Электрокардиография играет вспомогательную роль.В дифференциальном диагнозе необходимо исключить эндокардит и
Из книги Собаки и их разведение [Разведение собак] автора Хармар ХиллериРоль племенного кобеля в процессе спаривания Как только кобель будет достаточно стимулирован сукой и захочет ее повязать, он взбирается на нее и крепко охватывает ее передними ногами, кончик полового члена выходит из препуция и после серии сильных попыток приникает в
Из книги Служебная собака [Руководство по подготовке специалистов служебного собаководства] автора Крушинский Леонид Викторович5. Теория стадийного развития и особенности развития животных В основе управления развитием организмов лежит теория стадийного развития, которую сформулировал академик Т. Д. Лысенко, исходя из работы И. В. Мичурина и многочисленных собственных исследований.Несмотря на
Из книги Биология [Полный справочник для подготовки к ЕГЭ] автора Лернер Георгий Исаакович Из книги Основы психофизиологии автора Александров ЮрийДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СЕНСОРНАЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ Дифференциальная сенсорная чувствительность основана на способности сенсорной системы к различению сигналов. Важная характеристика каждой сенсорной системы – способность замечать различия в свойствах одновременно или
Из книги Эмбрионы, гены и эволюция автора Рэфф Рудольф А2.12. Дифференциальная чувствительность зрения Если на освещённую поверхность с яркостью I падает добавочное освещение dI, то, согласно закону Вебера, человек заметит разницу в освещённости только если dI/I = К, где К – константа, равная 0,01–0,015. Величину dI/I называют
Из книги Аквариум в школе автора Махлин Марк ДавидовичГлава 17 ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ПСИХОФИЗИОЛОГИЯ
Из книги Проблемы лечебного голодания. Клинико-экспериментальные исследования [все четыре части!] автора Анохин Петр КузьмичГибель клеток в процессе нормального развития Дегенерация вольфовых протоков в процессе развития особей женского пола и мюллеровых каналов у особей мужского пола - примеры наличия структур, которые вначале развиваются, а затем подвергаются некрозу. Эти процессы,
Из книги автораГены, вступающие в действие на более поздних стадиях развития и в процессе роста Ясно, что мутации генов, непосредственно определяющих морфогенетические пути, в особенности тех генов, которые действуют на ранних стадиях, могут вызывать чрезвычайно резкие изменения
Из книги автораГлава 10 Адаптации экспрессии генов в процессе развития Жизнь -это сила, которая проделывает бесчисленное множество экспериментов, пытаясь организовать себя... мамонт и человек, мышь и мегатерий, мухи и отцы церкви - все это результаты более или менее успешных попыток
Из книги автораСколько генов необходимо для развития? К счастью, существуют методы, позволяющие оценить количество генетической информации, имеющейся у высших организмов. Один из самых тонких таких методов - классическая менделевская генетика. Главная трудность, связанная с этим
Из книги автораЗНАЧЕНИЕ АКВАРИУМА В УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ Аквариумы всегда привлекают детей разного возраста, вызывают их удивление, возбуждают любознательность. Но в условиях школы, когда ставится задача использовать аквариум на уроках ботаники, зоологии, общей; биологии, его
Из книги автораСостояние больных в процессе лечения На основании клинических наблюдений и лабораторных исследований в динамике клинического состояния больных в процессе лечения можно было отметить 6 стадий, из которых 3 относятся к разгрузочному периоду и 3 - к восстановительному.Эти
Дифференциальная экспрессия генов Две клетки дифференцированы поразному, если, обладая одинаковым геномом, они синтезируют разные белки. Φ. ЖАКОБ и Ж. МОНО (1963)
Лекции Р. П. Костюченко Дифференциальная экспрессия генов 1960 -е 1. Каждое ядро соматической клетки содержит полный геном, возникающий при оплодотворении яйцеклетки. Это означает, что ДНК во всех дифференцированных клетках идентична. 2. Неиспользуемые гены в дифференцированных клетках не подвергаются разрушению или мутациям, они сохраняют способность к экспрессии. 3. Только небольшой процент генома экспрессируется в каждой клетке, часть РНК, синтезируемой в клетке, специфична для данного типа клеток. Экспрессия гена - реализация генетической информации, закодированной в гене
Механизмы дифференциальной экспрессии генов. Эпигенетический ландшафт Уоддингтона. Шарик на вершине изображает клетку, а долины под ним - различные пути развития, по которым она может пойти.
Регуляция экспрессии генов ядро цитоплазма Контроль деградации м. РНК ДНК Первичный транскрипт м. РНК Контроль транскрипции м. РНК Процессинг РНК м. РНК Контроль транспорта м. РНК Контроль деградации белка Деградация белка Контроль трансляции м. РНК Деградация м. РНК Неактив ный белок Контроль ферментативной активности белка Активный белок
Нуклеосома - базовая единица хроматиновой структуры гистоны (две молекулы каждого из гистонов H 2 A-H 2 B и гистонов H 3 -H 4), обернутых двумя витками ДНК. Динамичная структура, сворачивается/разворачивается около 4 раз в секунду. Модификации гистонов: «гистоновый код» ацетилирование гистонов - активирует транскрипцию («разрыхляя» хроматин) деацетилирование гистонов – Инактивирует метилирование гистонов – при метилировании по «хвостам» H 3, Н 4 – уплотнение хроматина, умолкание генов, гетерохроматинизация. хроматин - комплекс ДНК с белком
Считывание гистонового кода. Комплекс считывания кода связывается специфически свяжется только с областью хроматина, содержащей распознаваемые им метки, так что только определенная комбинация меток вызовет связывание комплекса с хроматином и привлечет дополнительные белковые комплексы, которые катализируют одну или несколько биологических функций.
Факторы транскрипции - белки, контролирующие процесс синтеза м. РНК на матрице ДНК путём связывания со специфичными участками ДНК. Транскрипционные факторы выполняют свою функцию либо самостоятельно, либо в комплексе с другими белками. Они обеспечивают снижение (репрессоры) или повышение (активаторы) константы связывания РНК-полимеразы с регуляторными последовательностями регулируемого гена. Определяющая черта факторов транскрипции - наличие в их составе одного или более ДНК-связывающих доменов, которые взаимодействуют с характерными участками ДНК, расположенными в регуляторных областях генов.
Конститутивные ТФ - присутствуют всегда во всех клетках - главные факторы транскрипции. Активируемые ТФ (активны в определенных условиях) – Участвующие в развитии организма (клеткоспецифичные) - экспрессия строго контролируется, но, начав экспрессироваться, не требуют дополнительной активации -, Myo. D, Myf 5, Hox. Сигнал-зависимые - требуют внешнего сигнала для активации - внеклеточные сигнал-зависимые - внутриклеточные сигнал-зависимые - мембраносвязанные рецептор-зависимые - фосфорилируются киназами сигнального каскада ДНК-связывающий домен типа «лейциновая молния» в комплексе с ДНК. резидентные ядерные факторы - находятся в ядре независимо от активации - CREB, AP-1, Mef 2 латентные цитоплазматические факторы - в неактивном состоянии локализованы в цитоплазме, после активации транспортируются в ядро - STAT, R-SMAD, NF-k. B, Notch,
Сборка комплекса инициации транскрипции у эукариот на последовательности ТАТА. Структура комплекса TATAсвязывающего белка/транскрипционного фактора TF(II)B из археи Pyrococcus woesei с ДНК
Регуляторные белки эукариот собираются в комплексы на ДНК. Природа и функция такого комплекса зависит от специфической последовательности ДНК, которая служит затравкой для их сборки. Белки, которые не связываются самостоятельно с ДНК, но собираются на других связывающихся с ДНК регуляторных белках, часто называются коактиваторами или корепрессорами (кофакторами) транскрипции. Под этим термином могут пониматься комплексы перестройки хроматина (напр. гистонацетилазы), белки, усиливающие сродство полимеразного комплекса к ДНК, или же просто белки-”строительные леса”, служащие основой для прикрепления обладающих специфической активностью белков.
Объединение множества входящих сигналов на промоторе. Чтобы воздействовать на инициацию транскрипции на промоторе, многочисленные белковые комплексы работают сообща. Конечная транскрипционная активность гена является результатом конкуренции между активаторами и репрессорами.
Энхансеры ДНК-последовательности, которая селективно повышают активность промотора, контролируя частоту осуществляющейся с него инициации транскрипции. Связывают транскрипционные (ко)факторы, которые способны увеличивать уровень транскрипции.
Экпрессия Pax-6 Энхансеры могут контролировать временную и тканеспецифическую экспрессию любого дифференциально регулируемого гена, так что различные типы генов имеют как правило различные энхансеры
Лекции Р. П. Костюченко Сайленсеры Районы ДНК, которые отвечают за репрессию транскрипции какого-либо гена. (Посредством привлечения белков с соответствующей активностью) Нейроспецифический сайленсерный элемент (neural restrictive silencer element) - NRSE; найден в регуляторных районах нескольких мышиных генов, экспрессия которых ограничена нервной системой Нейроспецифический сайленсерный фактор (neural restrictive silencer factor) - NRSF , по- видимому, синтезируется в каждой клетке организма, не являющейся зрелым нейроном по Гилберт, 2010
Лекции Р. П. Костюченко Инсуляторы Чтобы предотвратить распространение влияние энхансера (сайленсера) на соседние гены существуют определенные участки ДНК, которые связывают белки, блокирующие действие регуляторного элемента на соседний промотор. по Гилберт, 2010
Возможные варианты регуляции инициации транскрипции у прокариот (а) Связывание активатора с лигандом стимулирует сборку комплекса и транскрипцию (б) Активатор стимулирует транскрипцию, при связывании с лигандом дезактивируется. (в)Репрессор запрещает транскрипцию. Взаимодействие с лигандом инактивирует репрессор и позволяет транскрипцию. (г) В отсутствие лиганда репрессор не способен взаимодействов ать с ДНК, репрессия происходит только в присутствие лиганда 21
Клеточные сигнальные пути Каскады межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающие такую коммуникацию между клеточной мембраной и внутриклеточной точкой приложения, что способна привести к некоторым изменениям в клетке.
Точки приложения сигнальных каскадов Регуляция экспрессии генов (пролиферация, дифференцировка, выполнение функций) Изменение цитоскелета (изменение формы клетки, миграция, установление/разборка клеточных контактов) Влияние на метаболические пути (секреция метаболитов, регуляция активности ферментов) Не обязательно вовлекаются ДНК/РНК.
Способы передачи сигналов от клетки к клетке: Через воздействие паракринных факторов, взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом, через межклеточные контакты Диффузия растворимых сигнальных факторов Внеклеточный матрикс, секретируемый одной клеткой, вызывает изменения в другой Контакт между индуцирующей и отвечающей клетками
Источник сигнала Клетка-источник сигнала секретирует определённый тип сигнальной молекулы. Эта молекула детектируется клеткой-мишенью с помощью белка -рецептора, распознающего её и специфически с ней взаимодействующего. Каждая клетка способна отзываться на ограниченный набор сигнальных молекул. Реакция клетки на сигнал зависит от её состояния и типа дифференцировки.
Интеграция сигнала Сигналы из разных источников могут сходиться на The signals from several different sources may be integrated though a single shared protein (A) or protein complex (B) общем белке или белковом комплексе.
Амплификация сигнала 1 рецептор активирует множество G-белков 1 ligand-receptor 500 G-protein 500 enzymes Each enzyme Y produces many second messangers, each messanger activates 1 enzyme Y 105 (2 nd messanger) 250 (ion channels) 105 -107 (ions)
Ле Суперсемейство ростовых факторов TGF-β (TGF-β -суперсемейство) С другой стороны, структура белковучастников зачастую высококонсерватина. Зачастую белки, экспрессируемые в неродственном организме, способны функционально замещать гомологичные им белки хозяина. по Гилберт, 2010
Молекулярные взаимодействия Белок-белковые взаимодействия: ◦ Присоединение/диссоциация (Создание или разрушение белковых комплексов) ◦ Ковалентные модификации: фосфорилирование (tyr, thr, ser) ◦ Конформационные изменения ◦ Перемещение в другую функциональную область клетки ◦ Убиквитинирование и деградация Взаимодействие белков с малыми молекулами ◦ Присоединение/диссоциация, ведущая к изменению конформации, энергетического состояния ◦ Распространение вторичных мессенджеров (Ca 2+, ц. АМФ)
Фосфорилирование белков Привнесение двух отрицательных фосфатных зарядов может вызвать значительное конформационное изменение в белке за счёт, например, притяжения группы положительно заряженных боковых цепей аминокислот. Это может, в свою очередь, повлиять на связывание лигандов и тем самым заметно изменить активность фосфорилированного белка по сравнению с исходным.
Принципиальная схема влияния полученного сигнала на дифференциальную экспрессию генов Внешняя среда ядро цитоплазма Активный белок (1) Коактиваторы транскрипции Р Р Факторы транскрипции Перенос Активный белок (2) Лиганд Белок (2) Белковый комплекс Корепрессоры транскрипции Белок(2) n раз Деградация белка Белокрецептор
Лекции Р. П. Костюченко ПАРАКРИННЫЕ ФАКТОРЫ: сигнальный путь Wnt Семейство Wingless (Wnt-семейство) семейство гликопротеинов, богатых цистеином индуцируют дорсальные клетки сомитов становиться мышечными. участвуют в спецификации клеток среднего мозга Белки Wnt важны для становления полярности конечностей насекомых и позвоночных; они также участвуют в развитии (на различных этапах) мочеполовой системы Б - мочеполовой зачаток новорожденной самки мыши дикого типа. В - Мочеполовой зачаток самки мыши, нокаутированной по гену Wnt 4, с дефектом развития почки. Кроме того, яичник начинает синтезировать тестостерон и окружается системой протоков мужского типа. Фото J. Perasaari, S. Vainio
Лекции Р. П. Костюченко Юкстакринный (контактный) сигналинг: Сигнальный путь Notch. мембраносвязанные лиганды и рецепторы по Гилберт, 2010
Лекции Р. П. Костюченко Юкстакринный сигналинг первоначальные различия между клетками возникают случайно эти различия закрепляются по принципу обратной связи
Лекции Р. П. Костюченко Модель создания пространственной структуры нейробластов из исходно равноценных клеток нейрогенной эктодермы. Нейрогенные клетки производят сигнал в виде белка Delta (темная штриховка), а клетки, не становящиеся нейрогенными, продуцируют рецепторный белок Notch (белые)
Major themes in ST The “internal complexity” of each interaction The combinatorial nature of each component molecule (may receive and send multiple signals) The integration of pathways and networks
Общее представление о росте и развитии
О росте растений, казалось бы, можно судить по увеличению общей биомассы. Однако этот показатель весьма неоднозначен, поскольку сырая биомасса может не только увеличиваться, но и уменьшаться. Ещё один показатель роста – это увеличение числа клеток. Если число клеток растёт, можно уверенно говорить о росте, но постоянное число клеток ещё не говорит об отсутствии роста: в зоне растяжения увеличение числа клеток незначительно, тем не менее, рост идёт. О росте можно судить по увеличению линейных размеров – высоты растения, длины корня, ширины листа и т.д.
Таким образом, ростом можно называть необратимое увеличение растения хотя бы по одному из параметров: число клеток, линейные размеры, сырая/сухая биомасса.
Упрощённой моделью изменения параметров роста от времени является «кривая роста». Более подробно я буду говорить о ней ниже. Следует только отметить, что характер этой кривой способен резко меняться, в связи с действием на растение массы внешних факторов. Общая кривая роста, часто оказывается составленной разномасштабными S – образными участками. Таким образом, кривая роста целого растения обычно имеет более сложную форму.
Дифференцировка
Термин дифференцировка был введён для обозначения процесса приобретения различий между клетками (тканями, органами, системами органов и т.д.). Предполагается, что есть начальное недифференцированное состояние, когда наблюдатель не может установить различий между клетками, затем появляются видимые различия клеток и они становятся дифференцированными. Традиционно недифференцированными считают: делящиеся клетки эмбриона; меристематические клетки апексов корня и стебля, камбия, феллогена, интеркалярных меристем; клетки, неорганизованно делящиеся в экспериментальных условиях (суспензионная и каллусная культура in vitro).
Клетки, покинувшие зону деления, приступают к дифференцировке. Результат этого процесса можно увидеть, например, при образовании проводящей системы: возникает прокамбий, который дифференцируется на флоэму, ксилему и камбий. Во флоэме дифференцируются ситовидные элементы и клетки-спутницы, в ксилеме - паренхимные клетки и трахеиды, проводящий пучок может быть усилен дифференцирующимися механическими тканями и т.д. В данном примере клетки поэтапно приобретают анатомические различия в связи с выполняемыми функциями, многообразие клеток растет.
Анатомической дифференцировке предшествует биохимическая дифференцировка, когда видимых различий между клетками мало, но они, не одинаковы по содержанию тех или иных веществ. Удобнее следить за дифференциальной эспрессией генов: появлением новых или снижением уровня старых мРНК и белков. Эти данные позволяют зарегистрировать различия между клетками раньше, чем они станут видимыми на анатомическом уровне. Таким образом, дифференцировка начинается с изменения активности генома, экспрессии одних генов и подавления активности других.
При таком подходе делящиеся клетки меристемы придется считать дифференцированными, так как для прохождения клеточного цикла нужна определённая активность генома, которая и будет отличать эти клетки от других. Анатомы давно обратили внимание на неоднородность клеток меристемы. Можно сказать, что апикальная меристема корня дифференцирована на каллиптроген (инициали чехлика), дерматоген (инициали эпидермальной ткани), инициали коры, покоящийся центр и инициали осевого цилиндра. Для каждой из групп делящихся клеток характерны определенная локализация, направление веретена делений и тип производных клеток. Исследование меристемы методами молекулярной генетики показывает, что обнаруженная анатомами дифференцировка меристемы на зоны совпадает с зонами дифференциальной экспрессией определенных генов. Более того, саму меристему в целом можно достаточно четко выделить по зонам дифференциальной экспрессии. Таким образом, меристема является биохимически дифференцированной тканью.
Дифференциальная экспрессия генов - фундаментальное проявляение дифференцировки, и, как это ни парадоксально, недифференцированных клеток вообще не существует. Понятие «недифференцированный» хорошо работает только там, где в соответствии с задачами исследования исходные различия между клетками не учитывают (или нет методов их обнаружить).
Генетический анализ процесса развития предполагает его разложение на ряд промежуточных этапов, каждый из которых контролируется определённой генетической системой. Развитие есть результат совместной, возможно сменяющей друг друга активности двух генетических систем – первичной и вторичной. Под первичной системой понимается генетический контроль, жёстко регламентирующий переход развивающейся системы из одного состояния в другое, а под вторичной генетической регуляцией – способность системы достигать некоторого конечного состояния автоматически или авторегуляторно.
Геноконтролируемые этапы являются критическими периодами в развитии биологической системы, поскольку именно здесь происходят коренные изменения, связанные с формированием морфофункциональной структуры и определение принципов регулирования. В эти периоды создаются предпосылки негеноконтролируемых переходов системы, в которых она сохраняет свои качественные характеристики и свойства, а также демонстрирует низкую чувствительность к внешним и внутренним изменениям условий развития.
Итак, дифференцировкой можно назвать процесс изменения профиля генной активности, приводящий к дальнейшему изменению функции клеток.
Тотипотентность
В эмбриологии животных процесс дифференцировки изображают как сложный «ландшафт», по которому катится «шар». Шар - это символ клетки, дающей начало новому организму. В развилках шар «совершает выбор» и скатывается по одной из нескольких возможных траекторий. Так и клетки, возникшие при делении зиготы, направляются по одному из возможных путей дифференцировки. При этом клетки теряют «морфогенетический потенциал». Все «траектории» заканчиваются в «море», символизирующем смерть организма.
Если в начале пути у «шара» - клетки много потенциальных возможностей, то по мере приближения к «морю» их становится все меньше.
По имени ученого, предложившего такую аналогию, ее называют морфогенетическим ландшафтом Уоддингтона.
Процесс дифференцировки равносилен потере морфогенетического потенциала.
В отличие от клеток животных большинство клеток растений после анатомической дифференцировки легко переходят к делению. Такой процесс называют дедифференцировкой (потерей специализации). При механическом повреждении растения, а также в условиях эксперимента дедифференцировка приводит к образованию каллуса.
Из большинства клеток можно получить новый организм (для клеток животных это невозможно). Практически любая клетка многоклеточного организма содержит полный набор генов, необходимый для формирования организма, однако не каждая клетка может дать начало целому организму. Свойство клетки реализовать имеющуюся генетическую информацию и дать начало целому организму называют тотипотентностью. Тотипотентность клеток растения сравнительно легко реализовать, тогда, как большинство животных клеток не могут образовать новый организм. Таким образом, понятие дифференцировки как снижения морфогенетического потенциала, заимствованное из эмбриологии животных, не применимо к тотипотентным растительным клеткам, так как их морфогенетический потенциал долго остается высоким.
Идея о тотипотентности растительной клетки была выдвинута Г. Хаберландтом еще в 1902 г., хотя и не получила тогда экспериментального подтверждения. Согласно определению Хаберландта, любая клетка растения может дать начало новому организму, и если этого не наблюдается, то только потому, что растительный организм подавляет потенции клетки к развитию. Изоляция клеток от растений способствует проявлению этих потенций.
Благодаря разработке таких сложнейших биохимических методик стала возможна проверка гипотезы о дифференциальной экспрессии генов на молекулярном уровне; при этом следует выделить три постулата, которые необходимо подвергнуть проверке.
1. Ядро каждой клетки содержит полный геном, сформированный в оплодотворенном яйце. На молекулярном уровне это означает, что ДНК всех дифференцированных клеток идентична.
2. Неиспользуемые гены в дифференцированных клетках не разрушаются и не мутируют, они сохраняют способность к функционированию.
3. В каждой клетке экспрессируется лишь малая часть генома, при этом синтезируемая фракция РНК специфична для клеток данного типа.
Идентичность геномов
Мы уже рассмотрели некоторые генетические и эмбриологические данные, свидетельствующие об идентичности геномов. Аналогичные данные были получены также в ряде биохимических работ с использованием гибридизации нуклеиновых кислот.
Первое крупномасштабное молекулярное исследование идентичности ДНК в организме было выполнено в 1964 г. (McCarthy, Hoyer, 1964). Оказалось, что одноцепочечные ДНК, выделенные из мышиных клеток всех типов, с одинаковой эффективностью подавляют гибридизацию одноцепочечной ДНК с генами зародышей мыши. Это с достаточной убедительностью говорит о том, что ДНК в клетках всех типов одинакова по числу и типу последовательностей.
Данные о присутствии в дифференцированных клетках определенных генов, которые не синтезируют специфический для них продукт, были получены с помощью метода, названного гибридизацией in situ (Mary Lou Pardue, Gall, 1970). Гибридизация in situ проводится с политенными хромосомами, денатурированными таким образом, что цепи множественных спиралей ДНК уже разделены, однако хромосомы все еще видны на препаратах. Радиоактивную РНК или кДНК добавляют к денатурированной ДНК и затем после соответствующего периода инкубации препарат отмывают. В ходе инкубации РНК способна связаться с кодирующими ее участками ДНК. После промывки препараты покрывают прозрачной фотографической эмульсией. Радиоактивность связанной РНК сенсибилизирует зерна серебра в эмульсии, которые при проявлении эмульсии образуют черные точки над соответствующим диском хромосомы. Следовательно, с помощью РНК для определенного продукта можно выявить диск, в котором она синтезируется. На рис. 10.15 приведен радиоавтограф, который показывает локализацию генов для одного из желточных белков у дрозофилы. ДНК дрозофилы была клонирована и скринирована с помощью частично очищенной мРНК к этому белку; было обнаружено несколько клонов, ДНК которых обладала способностью направлять синтез желточного белка. Эти клоны были выращены и гены желточного белка выделены. Один из этих клонов был использован для получения радиоактивного зонда, который гибридизовали с препаратами политенных хромосом из клеток слюнных желез. Как видно из рисунка, полученная кДНК связывается с одним определенным диском. Однако слюнные железы не синтезируют данный белок. Единственными клетками, синтезирующими желточные белки в норме, являются ооциты и клетки жирового тела взрослой самки. Таким образом, было показано, что ген, активный исключительно в клетках жирового тела взрослой особи и в ооцитах, присутствует в хромосомах слюнных желез личинки.
Стабильность генов
Оказалось возможным показать также, что гены, неиспользуемые в дифференцированных клетках, при определенных условиях могут быть активиро-
Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.
__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ______________ 93
ваны и что они могут продуцировать белки, специфичные для клеток других типов. Убедительные данные о реактивации неиспользуемых генов у млекопитающих были получены в лаборатории Μэри Вейс (Peterson, Weiss, 1972; Brown, Weiss, 1975) при использовании методики слияния дифференцированных клеток различных типов. Клетки могут сливаться естественным образом (как в случае развития мыши), или их можно искусственно стимулировать к слиянию, воздействуя такими агентами, как инактивированный вирус Сендай (вирус мышиной кори) или полиэтиленгликоль 1 . При слиянии клеток возникает ситуация, при которой два ядра оказываются в обшей цитоплазме (рис. 10.16). В благоприятных условиях оба ядра гибридной клетки одновременно войдут в митоз и в результате образуют гибридное ядро, содержащее хромосомы из родительских клеток обоих типов. В большинстве случаев, когда клетки двух различных типов сливаются друг с другом, полученный гибрид теряет свойства, характерные для родительских клеток. В результате слияния опухолевых клеток из печени крысы с фибробластами мыши Вейс смогла получить гибриды, содержащие два набора хромосом из печени на один набор из фибробластов. Эти клетки сохранили способность синтезировать белки, специфичные для печени крысы, такие, как альбумин, альдолаза и тирозинаминотрансфераза (ТАТ). Более удивительно, что кроме этих белков они синтезировали также мышиные альбумин, альдолазу и ТАТ – три белка, которые никогда не синтезируются фибробластами. Фибробласты мыши сохранили гены, специфичные для печени, в форме, которая допускает их экспрессию в определенных условиях. Эта ситуация соответствует общему правилу развития животных: в процессе дифференцировки клеток необратимых генетических изменений не происходит.