Одна из наиболее важных задач фармацевтической химии - это разработка и совершенствование методов оценки качества лекарственных средств.
Для установления чистоты лекарственных веществ используют различные физические, физико-химические, химические методы анализа или их сочетание.
ГФ предлагает следующие методы контроля качества ЛС.
Физические и физико-химические методы. К ним относятся: определение температур плавления и затвердевания, а также температурных пределов перегонки; определение плотности, показателей преломления (рефрактометрия), оптического вращения (поляриметрия); спектрофотометрия - ультрафиолетовая, инфракрасная; фотоколориметрия, эмиссионная и атомно-абсорбционная спектрометрия, флуориметрия, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, масс-спектрометрия; хроматография - адсорбционная, распределительная, ионообменная, газовая, высокоэффективная жидкостная; электрофорез (фронтальный, зональный, капиллярный); электрометрические методы (потенциометрическое определение pH, потенциометрическое титрование, амперометрическое титрование, вольтамперометрия).
Кроме того, возможно применение методов, альтернативных фармакопейным, которые иногда имеют более совершенные аналитические характеристики (скорость, точность анализа, автоматизация). В некоторых случаях фармацевтическое предприятие приобретает прибор, в основе использования которого лежит метод, еще не включенный в Фармакопею (например, метод рама- новской спектроскопии - оптический дихроизм). Иногда целесообразно при определении подлинности или испытании на чистоту заменить хроматографическую методику на спектрофотометрическую. Фармакопейный метод определения примесей тяжелых металлов осаждением их в виде сульфидов или тио- ацетамидов обладает рядом недостатков. Для определения примесей тяжелых металлов многие производители внедряют такие физико-химические методы анализа, как атомно-абсорбционная спектрометрия и атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой.
Важной физической константой, характеризующей подлинность и степень чистоты ЛС, является температура плавления. Чистое вещество имеет четкую температуру плавления, которая изменяется в присутствии примесей. Для лекарственных веществ, содержащих некоторое количество допустимых примесей, ГФ регламентирует интервал температуры плавления в пределах 2 °С. Но в соответствии с законом Рауля (АТ = iK3C, где АТ - понижение температуры кристаллизации; К3 - криоскопическая постоянная; С - концентрация) при і = 1 (неэлектролит) значение А Г не может быть одинаковым для всех веществ. Это связано не только с содержанием примесей, но и с природой самого ЛВ, т. е. с величиной криоскопической постоянной К3, отражающей молярное понижение температуры плавления ЛВ. Таким образом, при одинаковом АТ = = 2 °С для камфоры (К3 = 40) и фенола (К3 = 7,3) массовые доли примесей не равны и составляют соответственно 0,76 и 2,5 %.
Для веществ, которые плавятся с разложением, обычно указывается температура, при которой вещество разлагается и происходит резкое изменение его вида.
В некоторых частных статьях ГФ X рекомендуется определять температуру затвердевания или температуру кипения (по ГФ XI - «температурные пределы перегонки») для ряда жидких ЛС. Температура кипения должна укладываться в интервал, приведенный в частной статье.
Более широкий интервал свидетельствует о присутствии примесей.
Во многих частных статьях ГФ X приведены допустимые значения плотности, реже вязкости, подтверждающие подлинность и доброкачественность ЛС.
Практически все частные статьи ГФ X нормируют такой показатель качества ЛС, как растворимость в различных растворителях. Присутствие примесей в ЛВ может повлиять на его растворимость, снижая или повышая ее в зависимости от природы примеси.
Критериями чистоты являются также цвет ЛВ и/или прозрачность жидких лекарственных форм.
Определенным критерием чистоты ЛС могут служить такие физические константы, как показатель преломления луча света в растворе испытуемого вещества (рефрактометрия) и удельное вращение, обусловленное способностью ряда веществ или их растворов вращать плоскость поляризации при прохождении через них плоскополяризованного света (поляриметрия). Методы определения этих констант относятся к оптическим методам анализа и применяются также для установления подлинности и количественного анализа ЛС и их лекарственных форм.
Важным критерием доброкачественности целого ряда ЛС является содержание в них воды. Изменение этого показателя (особенно при хранении) может изменить концентрацию действующего вещества, а, следовательно, и фармакологическую активность и сделать ЛС не пригодным к применению.
Химические методы. К ним относятся: качественные реакции на подлинность, растворимость, определение летучих веществ и воды, определение содержания азота в органических соединениях, титриметрические методы (кислотно-основное титрование, титрование в неводных растворителях, комплек- сонометрия), нитритометрия, кислотное число, число омыления, эфирное число, йодное число и др.
Биологические методы. Биологические методы контроля качества ЛС весьма разнообразны. Среди них испытания на токсичность, стерильность, микробиологическую чистоту.
Для проведения физико-химического анализа полупродуктов, субстанций лекарственных средств и готовых лекарственных форм при проверке их качества на соответствие требованиям ФС контрольно-аналитическая лаборатория должна быть оснащена следующим минимальным набором оборудования и приборов:
ИК-спектрофотометр (для определения подлинности);
спектрофотометр для спектрометрии в видимой и УФ-области (определение подлинности, количественное определение, однородность дозирования, растворимость);
оборудование для тонкослойной хроматографии (ТСХ) (определение подлинности, родственных примесей);
хроматограф для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (определение подлинности, количественное определение, определение родственных примесей, однородности дозирования, растворимости);
газожидкостной хроматограф (ГЖХ) (содержание примесей, определение однородности дозирования);
поляриметр (определение подлинности, количественное определение);
потенциометр (измерение pH, количественное определение);
атомно-абсорбционный спектрофотометр (элементный анализ тяжелых металлов и неметаллов);
титратор К. Фишера (определение содержания воды);
дериватограф (определение потери массы при высушивании).
Вступление
1.2 Ошибки, возможные при проведении фармацевтического анализа
1.3 Общие принципы испытаний подлинности лекарственных веществ
1.4 Источники и причины недоброкачественности лекарственных веществ
1.5 Общие требования к испытаниям на чистоту
1.6 Методы фармацевтического анализа и их классификация
Глава 2. Физические методы анализа
2.1 Проверка физических свойств или измерение физических констант лекарственных веществ
2.2 Установление рН среды
2.3 Определение прозрачности и мутности растворов
2.4 Оценка химических констант
Глава 3. Химические методы анализа
3.1 Особенности химических методов анализа
3.2 Гравиметрический (весовой) метод
3.3 Титриметрические (объемные) методы
3.4 Газометрический анализ
3.5 Количественный элементный анализ
Глава 4. Физико-химические методы анализа
4.1 Особенности физико-химических методов анализа
4.2 Оптические методы
4.3 Абсорбционные методы
4.4 Методы, основанные на испускании излучения
4.5 Методы, основанные на использовании магнитного поля
4.6 Электрохимические методы
4.7 Методы разделения
4.8 Термические методы анализа
Глава 5. Биологические методы анализа1
5.1 Биологический контроль качества лекарственных средств
5.2 Микробиологический контроль лекарственных средств
Список использованной литературы
Вступление
Фармацевтический анализ - это наука о химической характеристике и измерении биологически активных веществ на всех этапах производства: от контроля сырья до оценки качества полученного лекарственного вещества, изучения его стабильности, установления сроков годности и стандартизации готовой лекарственной формы. Фармацевтический анализ имеет свои специфические особенности, отличающие его от других видов анализа. Эти особенности заключаются в том, что анализу подвергают вещества различной химйческой природы: неорганические, элементорганические, радиоактивные, органические соединения от простых алифатических до сложных природных биологически активных веществ. Чрезвычайно широк диапазон концентраций анализируемых веществ. Объектами фармацевтического анализа являются не только индивидуальные лекарственные вещества, но и смеси, содержащие различное число компонентов. Количество лекарственных средств с каждым годом увеличивается. Это вызывает необходимость разработки новых способов анализа.
Способы фармацевтического анализа нуждаются в систематическом совершенствовании в связи с непрерывным повышением требований к качеству лекарственных средств, причем растут требования как к степени чистоты лекарственных веществ, так и к количественному содержанию. Поэтому необходимо широкое использование не только химических, но и более чувствительных физико-химических методов для оценки качества лекарств.
К фармацевтическому анализу предъявляют высокие требования. Он должен быть достаточно специфичен и чувствителен, точен по отношению к нормативам, обусловленным ГФ XI, ВФС, ФС и другой НТД, выполняться в короткие промежутки времени с использованием минимальных количеств испытуемых лекарственных препаратов и реактивов.
Фармацевтический анализ в зависимости от поставленных задач включает различные формы контроля качества лекарств: фармакопейный анализ, постадийный контроль производства лекарственных средств, анализ лекарственных форм индивидуального изготовления, экспресс-анализ в условиях аптеки и биофармацевтический анализ.
Составной частью фармацевтического анализа является фармакопейный анализ. Он представляет собой совокупность способов исследования лекарственных препаратов и лекарственных форм, изложенных в Государственной фармакопее или другой нормативно-технической документации (ВФС, ФС). На основании результатов, полученных при выполнении фармакопейного анализа, делается заключение о соответствии лекарственного средства требованиям ГФ или другой нормативно-технической документации. При отклонении от этих требований лекарство к применению не допускают.
Заключение о качестве лекарственного средства можно сделать только на основании анализа пробы (выборки). Порядок ее отбора указан либо в частной статье, либо в общей статье ГФ XI (вып. 2). Отбор пробы производят только из неповрежденных укупоренных и упакованных в соответствии с требованиями НТД упаковочных единиц. При этом должны строго соблюдаться требования к мерам предосторожности работы с ядовитыми и наркотическими лекарственными средствами, а также к токсичности, огнеопасности, взрывоопасности, гигроскопичности и другим свойствам лекарств. Для испытания на соответствие требованиям НТД проводят многоступенчатый отбор проб. Число ступеней определяется видом упаковки. На последней ступени (после контроля по внешнему виду) берут пробу в количестве, необходимом для четырех полных физико-химических анализов (если проба отбирается для контролирующих организаций, то на шесть таких анализов).
Из расфасовки "ангро" берут точечные пробы, взятые в равных количествах из верхнего, среднего и нижнего слоев каждой упаковочной единицы. После установления однородности все эти пробы смешивают. Сыпучие и вязкие лекарственные средства отбирают пробоотборником, изготовленным из инертного материала. Жидкие лекарственные средства перед отбором проб тщательно перемешивают. Если это делать затруднительно, то отбирают точечные пробы из разных слоев. Отбор выборок готовых лекарственных средств осуществляют в соответствии с требованиями частных статей или инструкций по контролю, утвержденных МЗ РФ.
Выполнение фармакопейного анализа позволяет установить подлинность лекарственного средства, его чистоту, определить количественное содержание фармакологически активного вещества или ингредиентов, входящих в состав лекарственной формы. Несмотря на то, что каждый из этих этапов имеет свою конкретную цель, их нельзя сматривать изолированно. Они взаимосвязаны и взаимно дополняют друг друга. Так, например, температура плавления, растворимость, рН среды водного раствора и т.д. являются критериями как подлинности, так и чистоты лекарственного вещества.
Глава 1. Основные принципы фармацевтического анализа
1.1 Критерии фармацевтического анализа
На различных этапах фармацевтического анализа в зависимости от поставленных задач имеют значение такие критерии, как избирательность, чувствительность, точность, время, затраченное на выполнение анализа, израсходованное количество анализируемого препарата (лекарственной формы).
Избирательность метода очень важна при проведении анализа смесей веществ, поскольку дает возможность получать истинные значения каждого из компонентов. Только избирательные методики анализа позволяют определять содержание основного компонента в присутствии продуктов разложения и других примесей.
Требования к точности и чувствительности фармацевтического анализа зависят от объекта и цели исследования. При испытании степени чистоты препарата используют методики, отличающиеся высокой чувствительностью, позволяющие устанавливать минимальное содержание примесей.
При выполнении постадийного контроля производства, а также при проведении экспресс-анализа в условиях аптеки важную роль имеет фактор времени, которое затрачивается на выполнение анализа. Для этого выбирают методы, позволяющие провести анализ в наиболее короткие промежутки времени и вместе с тем с достаточной точностью.
При количественном определении лекарственного вещества используют метод, отличающийся избирательностью и высокой точностью. Чувствительностью метода пренебрегают, учитывая возможность выполнения анализа с большой навеской препарата.
Мерой чувствительности реакции является предел обнаружения. Он означает наименьшее содержание, при котором по данной методике можно обнаружить присутствие определяемого компонента с заданной доверительной вероятностью. Термин ""предел обнаружения" введен вместо такого понятия, как "открываемый минимум", им пользуются также взамен термина "чувствительность". На чувствительность качественных реакций оказывают влияние такие факторы, как объемы растворов реагирующих компонентов, концентрации реактивов, рН среды, температура, продолжительность опыта. Это следует учитывать при разработке методик качественного фармацевтического анализа. Для установления чувствительности реакций все шире используют показатель поглощения (удельный или молярный), устанавливаемый спектрофотометрическим методом. В химическом анализе чувствительность устанавливают по величине предела обнаружения данной реакции. Высокой чувствительностью отличаются физико-химические методы анализа. Наиболее высокочувствительны радиохимические и масс-спектральный методы, позволяющие определять 10 -8 -10 -9 % анализируемого вещества, полярографические и флуориметрические 10 -6 -10 -9 %; чувствительность спектрофотометрических методов Ю -3 -10 -6 %, потенциометрических 10 -2 %.
Термин "точность анализа" включает одновременно два понятия: воспроизводимость и правильность полученных результатов. Воспроизводимость характеризует рассеяние результатов анализа по сравнению со средним значением. Правильность отражает разность между действительным и найденным содержанием вещества. Точность анализа у каждого метода различна и зависит от многих факторов: калибровки измерительных приборов, точности отвешивания или отмеривания, опытности аналитика и т.д. Точность результата анализа не может быть выше, чем точность наименее точного измерения.
Как известно, проведение фармакопейного анализа ставит своей целью установление подлинности, определение чистоты и количественную оценку действующего вещества или ингредиентов сложной ЛФ. Несмотря на то, что каждый из этих этапов фармакопейного анализа решает свою конкретную задачу, их нельзя рассматривать изолированно. Так выполнение реакции подлинности иногда дает ответ на наличие или отсутствие той или иной примеси. В препарате ПАС-Nа проведение качественной реакции с раствором хлорида железа (III) (как производное салициловой кислоты образует фиолетово-красное окрашивание). А вот появление через три часа осадка в этом растворе свидетельствует о наличии примеси 5-аминосалициловой кислоты, фармакологически не активной. Однако такие примеры довольно редки.
Определение же некоторых констант – температуры плавления, плотности, удельного показателя поглощения, позволяет одновременно сделать вывод и о подлинности и о чистоте данного вещества. Так как методики определения тех или иных констант для различных препаратов идентичны, мы изучаем их в общих методах анализа. Знание теоретических основ и умение провести определение потребуется вам в последующем анализе различных групп препаратов.
Фармакопейный анализ является составной частью фармацевтического анализа и представляет собой совокупность способов исследования лекарственных средств и лекарственных форм, изложенных в Государственной фармакопее и другой НД (ФС, ФСП, ГОСТ) и используемых для определения подлинности, чистоты и количественного анализа.
В контроле качества лекарственных средств используют физические, физико-химические, химические и биологические методы анализа. Испытания по НД включают несколько основных стадий:
описание;
растворимость;
подлинность;
физические константы (температура плавления, кипения или перегонки, показатель преломления, удельное вращение, плотность, спектральные характеристики);
прозрачность и цветность растворов;
кислотность или щёлочность, рН раствора;
определение примесей;
потеря в массе при высушивании;
сульфатная зола;
количественное определение.
В зависимости от природы лекарственного средства некоторые из этих испытаний могут либо отсутствовать, либо включены другие, например, кислотное число, йодное число, число омыления и др.
Частная фармакопейная статья на любой препарат начинается разделом «Описание», в котором в основном приводится характеристика физических свойств вещества:
агрегатного состояния (твердое вещество, жидкость, газ), если твердое вещество, то определяется степень его дисперсности (мелкокристаллический, крупнокристаллический), форма кристаллов (игольчатые, цилиндрические)
цвет вещества – важный показатель подлинности и чистоты. Большинство ЛС не имеют окраски, то есть являются белыми. Окраску визуально при определении агрегатного состояния. Небольшое количество вещества помещают тонким слоем на чашку Петри или часовое стекло и рассматривают на белом фоне. В ГФ Х1 имеется статья «Определение степени белизны порошкообразных ЛС». Определение проводится инструментальным методом на специальных фотометрах «Specol-10». Оно основано на спектральной характеристике света, отраженного от образца ЛВ. Измеряют так называемыйкоэффициент отражения – отношение величины отраженного светового потока к величине падающего. Измеренные коэффициенты отражения позволяют определить наличие или отсутствие у веществ цветового или сероватого оттенка путем расчета степени белизны (α) и степени яркости (β). Так как появление оттенков или изменение цвета является, как правило, следствием химических процессов – окисления, восстановления, то уже этот начальный этап исследования веществ позволяет сделать выводы. Этот метод исключен из ГФ Х11 издания.
Запах определяют редко сразу после вскрытия упаковки на расстоянии 4-6 см. Отсутствие запаха после вскрытия упаковки сразу по методике : 1-2 г вещества равномерно распределяют на часовом стекле диаметром 6-8 см и через 2 мин определяют запах на расстоянии 4-6 см.
В разделе «Описание» могут быть указания на возможность изменения веществ в процессе хранения . Например, в препарате кальция хлорид указано, что он очень гигроскопичен и расплывается на воздухе, а натрия йодид – на воздухе сыреет и разлагается с выделением йода, кристаллогидраты, в случае выветривания или несоблюдения условий кристаллизации в производстве, уже не будут иметь нужный внешний вид ни по форме кристаллов, ни по цвету.
Таким образом исследование внешнего вида вещества является первым, но очень важным этапом в анализе веществ и необходимо уметь связать изменения внешнего вида с возможными химическими изменениями и сделать правильный вывод.
Растворимость (ГФ XI, вып. 1, с. 175, ГФ XII, вып. 1, с. 92)
Растворимость является важным показателем качества лекарственного вещества. Как правило, в НД приводится некоторый перечень растворителей, наиболее полно характеризующий это физическое свойство с тем, чтобы в дальнейшем оно могло быть использовано для оценки качества на том или ином этапе исследования этого лекарственного вещества. Так, растворимость в кислотах и щелочах характерна для амфотерных соединений (цинка оксид, сульфаниламиды), для органических кислот и оснований (кислоты глютаминовая, ацетилсалициловая, кодеин). Изменение растворимости указывает на присутствие или появление при хранении менее растворимых примесей, что характеризует изменение его качества.
В ГФ XI под растворимостью подразумевают не физическую константу, а свойство, выраженное приблизительными данными и служащее для ориентировочной характеристики препаратов.
Наряду с температурой плавления растворимость вещества при постоянной температуре и давлении является одним из параметров , по которому устанавливают подлинность и чистоту (доброкачественность) практически всех лекарственных средств.
Рекомендуется использовать растворители разной полярности (обычно три); не рекомендуется использование легкокипящих и легковоспламеняющихся (диэтиловый эфир) или очень токсичных (бензол, метиленхлорид) растворителей.
Фармакопеей XI изд. приняты два способа выражения растворимости :
В частях (соотношение вещества и растворителя) . Например, для натрия хлорида по ФС растворимость в воде выражена в соотношении 1:3, это означает, что для растворения 1 г лекарственного вещества необходимо не более 3 мл воды.
В условных терминах (ГФ XI, с.176). Например, для натрия салицилата в ФС дана растворимость в условных терминах – «очень легко растворим в воде». Это означает, что для растворения 1 г вещества необходимо до 1 мл воды.
Фармакопеей XII изд.только в условных (в пересчете на 1 г)
Условные термины и их значения приведены в табл. 1. (ГФ XI, вып. 1, с. 176, ГФ XII, вып. 1, с. 92).
Условные термины растворимости
|
Условные термины |
Сокращения |
Количество растворителя (мл), необходимое для растворения 1г вещества |
|
Очень легко растворим | ||
|
Легко растворим |
Более 1 до 10 |
|
|
Растворим | ||
|
Умеренно растворим | ||
|
Мало растворим |
» 100 до 1000 |
|
|
Очень мало растворим |
» 1000 до 10000 |
|
|
Практически не растворим |
Условный термин соответствует определённому интервалу объёмов растворителя (мл), в пределах которого должно происходить полное растворение одного грамма лекарственного вещества.
Процесс растворения осуществляют в растворителях при температуре 20°С . С целью экономии лекарственного вещества и растворителя массу препарата отвешивают с таким расчётом (с точностью до 0,01 г), чтобы на установление растворимости воды расходовалось не более 100 мл, а органических растворителей - не более 10-20 мл.
Лекарственное вещество (субстанцию) считают растворимым , если в растворе при наблюдении в проходящем свете не обнаруживаются частицы вещества.
Методика . (1 способ). Отвешенную массу лекарственного средства, предварительно растёртого в тонкий порошок, вносят в отмеренный объём растворителя, соответствующий минимальному его объёму, встряхивают. Затем в соответствии с табл. 1 добавляют постепенно растворитель до максимального его объёма и непрерывно встряхивают в течение 10 мин. По истечений этого времени в растворе невооружённым глазом не должны обнаруживаться частицы вещества. Например, отвешивают 1 г натрия бензоата, помещают в пробирку с 1 мл воды, взбалтывают и постепенно приливают 9 мл воды, т.к. натрия бензоат легко растворим в воде (от 1 до 10 мл).
Для медленно растворимых лекарственных средств, требующих для полного растворения более 10 мин., допускается нагревание на водяной бане до 30°С. Наблюдение проводят после охлаждения раствора до 20°С и энергичного встряхивания в течение 1-2 мин. Например, кофеин медленно растворим в воде (1:60), кодеин медленно и мало растворим в воде (100-1000), кальция глюконат медленно растворим в 50 ч. воды, кальция лактат медленно растворим в воде, кислота борная медленно растворима в 7 ч. глицерина.
2 способ. Растворимость, выраженная в частях, показывает объём растворителя в мл, необходимого для растворения 1 г вещества.
Методика . (2 способ) Взвешенную на ручных весах массу лекарственного средства растворяют в указанном НД объёме растворителя. В растворе не должны обнаруживаться частицы не растворившегося вещества.
Растворимость в частях указывается в фармакопейных статьях для следующих препаратов: кислота борная (растворим в 25 ч. воды, в 25 ч. спирта, в 4 ч. кипящей воды);калия иодид (растворим в 0,75 ч. воды, в 12 ч. спирта и в 2,5 ч. глицерина);натрия бромид (растворим в 1,5 ч. воды, в 10 ч. спирта);калия бромид (растворим в 1,7 ч. воды и м.р. спирте);калия хлорид и натрия хлорид (р. в 3 ч. воды).
В случае испытания, например, натрия бромида поступают так: отвешивают на ручных весочках 1 г натрия бромида, добавляют 1,5 мл воды и взбалтывают до полного растворения.
Общая фармакопейная статья «Растворимость » ГФ XII изд.дополнена описанием методик определения растворимости веществ с неизвестной и известной растворимостью.
Температура плавления (Т °пл)
Температура плавления является константой, характеризующей чистоту вещества и одновременно его подлинность . Из физики известно, что температура плавления – это температура, при которой твердая фаза вещества находится в равновесии с расплавом. Чистое вещество имеет четкую температуру плавления. Поскольку ЛВ могут иметь незначительное количество примесей, такой четкой картины мы уже не увидим. В этом случае определяется интервал, при котором плавится вещество. Обычно этот интервал лежит в пределах 2 ◦ С. Более растянутый интервал свидетельствует о наличии примесей в недопустимых пределах.
Согласно формулировке ГФ Х1 под температурой плавления вещества понимают интервал температуры между началом плавления (появлением первой капли жидкости) и концом плавления (полным переходом вещества в жидкое состояние).
Если вещество имеет нечеткое начало или конец плавления , определяют температуру только начала или конца плавления . Иногда вещество плавится с разложением, в этом случае определяют температуру разложения , то есть температуру, при которой происходит резкое изменение вещества (например, вспенивание).
Методы определения температуры плавления
Выбор метода диктуется двумя моментами:
устойчивостью вещества при нагревании и
способностью растираться в порошок.
Согласно ГФ Х1 издания, существует 4 способа определения Т °пл:
Метод 1 – для веществ, способных растираться в порошок, устойчивых при нагревании
Метод 1а – для веществ, способных растираться в порошок, не устойчивых при нагревании
Методы 2 и 3 – для веществ, не растирающихся в порошок
Методы 1, 1а и 2 предполагают использование 2х приборов:
ПТП (прибор для определения Тпл ): знаком Вам с курса органической химии, позволяет определить Тпл веществ в пределах от 20 ◦ С до 360 ◦ С
Прибор, состоящий из круглодонной колбы с впаянной в нее пробиркой, в которую вставляется термометр с прикрепленным к нему капилляром, содержащим исходное вещество . Во внешнюю колбу залита на ¾ объема жидкость-теплоноситель:
вода (позволяет определить Тпл до 80 ◦ С),
вазелиновое масло или жидкие силиконы, концентрированная серная кислота (позволяет определить Тпл до 260 ◦ С),
смесь серной кислоты и сульфата калия в соотношении 7:3 (позволяет определить Тпл выше 260 ◦ С)
Методика общая независимо от прибора.
Тонко измельченное сухое вещество помещают в капилляр средних размеров (6-8 см) и вносят в прибор при температуре на 10 градусов ниже ожидаемой. Отрегулировав скорость подъема температуры, фиксируют температурный интервал изменений вещества в капилляре При этом проводят не менее 2х определений и берут среднее арифметическое.
Тпл определяют не только у чистых веществ, но и у их производных – оксимов, гидразонов, оснований и кислот, выделенных из их солей.
В отличие от ГФ XI в ГФ XII изд. температура плавления в капиллярном методе означает не интервал между началом и концом плавления, а температуру конца плавления , что согласуется с Европейской фармакопеей.
Температурные пределы перегонки (Т ° кип.)
ГФ величина определяется как интервал между начальной и конечной температурой кипения при нормальном давлении. (101,3 кПа – 760 мм рт.ст.). Интервал обычно составляет 2°.
Под начальной Т°кип. понимают температуру, при которой в приемник перегнались первые пять капель жидкости.
Под конечной – температуру, при которой в приемник перешло 95% жидкости.
Более растянутый интервал, чем указано в соответствующей ФС, свидетельствует о наличие примесей.
Прибор для определения ТПП состоит из
термостойкой колбы с термометром, в которую помещают жидкость,
холодильника и
приемной колбы (градуированного цилиндра).
ТПП, наблюдаемые в опыте, приводят к нормальному давлению по формуле:
Тиспр = Тнабл + К· (р – р 1)
Где: р – нормальное барометрическое давление (760 мм рт ст)
р 1 – барометрическое давление во время опыта
К – прирост Ткип на 1мм давления
Таким образом определяя температурные пределы перегонки определяют подлинность и чистоту эфира, этанола, хлорэтила, фторотана.
ОФС ГФ XII «Определение температурных пределов перегонки » дополнена определением точки кипения и в частных ФС рекомендует определять температуру затвердевания или кипения для жидких ЛВ.
Плотность (ГФ XI, вып. 1, с. 24)
Плотность – это масса единицы объема вещества. Выражается в г/см 3 .
ρ = m / V
Если массу измерить в гр, а объем в см 3 , то плотность – это масса 1 см 3 вещества.
Определение плотности проводят с помощью пикнометра (до 0,001). или ареометра (точность измерения до 0,01)
Устройство приборов смотрите в ГФ Х1 издании.
Целью исследования лекарственных веществ является установление пригодности лекарственного средства для медицинского применения, т.е. соответствия его нормативному документу на данный препарат.
Фармацевтический анализ – это наука о химической характеристике и измерении биологически активных веществ на всех этапах производства: от контроля сырья до оценки качества полученного лекарственного вещества, изучения его стабильности, установления сроков годности и стандартизации готовой лекарственной формы. Особенностями фармацевтического анализа является его многогранность и многообразие веществ или их смесей, в том числе индивидуальные химические вещества, сложные смеси биологических веществ (белков, углеводом, олигопептидов и т.д.). Способы анализа нуждаются в постоянном совершенствовании и,если в УП фармакопее превалировали химические методы, в том числе качественные реакции, то на современном этапе используются преимущественно физико-химические и физические методы анализа.
Фармацевтический анализ в зависимости от поставленных задач включает различные аспекты контроля качества лекарств:
1. Фармакопейный анализ;
2. Постадийный контроль производства лекарственных средств;
3. Анализ лекарственных средств индивидуального изготовления.
Основным и наиболее существенным является фармакопейный анализ, т.е. анализ лекарственных средств на соответствие стандарту – фармакопейной статье или иному НД и, таким образом, подтверждение его пригодности. Отсюда и требования к высокой специфичности, селективности, точности и достоверности анализа.
Заключение о качестве лекарственного средства можно сделать только на основании анализа пробы (статистически достоверной выборки). Порядок отбора пробы указан либо в частной статье, либо в общей статье ГФ Х1 изд. (вып.2) с.15. Для проведения испытания лекарственных средств на соответствие требованиям нормативно-технической документации проводят многоступенчатый отбор проб (выборок). При многоступенчатом отборе пробу (выборку) образуют по ступеням и продукцию в каждой ступени отбирают случайным образом в пропорциональных количествах из единиц, отобранных в предыдущей ступени. Число ступеней определяется видом упаковки.
1 ступень: отбор единиц упаковочной тары (ящиков, коробок и т.д.);
2 ступень: отбор упаковочных единиц, находящихся в упаковочной таре (коробок, флаконов, банок и т.д.);
3 ступень: отбор продукции в первичной упаковке (ампул, флаконов, контурных упаковок и т.д.).
Для расчета отбора количества продукции на каждой ступени используют формулу:
где n – количество упаковочных единиц данной ступени.
Конкретный порядок формирования выборки подробно описан в ГФ Х1 издания, вып.2. При этом анализ считается достоверным при воспроизводимости как минимум четырех проб.
Критерии фармацевтического анализа
Для различных целей анализа имеют значения такие критерии как избирательность анализа, чувствительность, точность, время выполнения анализа, количество испытуемого вещества.
Избирательность анализа имеет существенное значение при анализе сложных препаратов, состоящих из нескольких действующих компонентов. В этом случае очень важна избирательность анализа для количественного определения каждого из веществ.
Требования к точности и чувствительности зависят от объекта и цели исследования. При испытании чистоты или примесей используют высокочувствительные методы. Для постадийного контроля производства важен фактор времени, затрачиваемый на анализ.
Важным параметром метода анализа является предел чувствительности метода. Этот предел означает наименьшее содержание, при котором можно достоверно обнаружить данное вещество. Наименее чувствительными являются химические методы анализа и качественные реакции. Самые чувствительные ферментные и биологические методы, позволяющие обнаруживать единичные макромолекулы веществ. Из реально применяемых самыми чувствительными являются радиохимический, каталитический и флуоресцентный методы, позволяющие определять до 10 -9 %; чувствительность спектрофотометрических методов 10 -3 -10 -6 %; потенциометрических 10 -2 %.
Термин «точность анализа» включает одновременно два понятия: воспроизводимость и правильность полученных результатов.
Воспроизводимость – характеризует рассеяние результатов анализа по сравнению со средним значением.
Правильность – отражает разность между действительным и найденным содержанием вещества. Точность анализа зависит от качества приборов, опытности аналитика и т.д. Точность анализа не может быть выше, чем точность наименее точного измерения. Это означает, что если при титровании точность составляет ±0,2 мл плюс ошибка от натекания тоже ±0,2 мл, т.е. суммарно ±0,4 мл то при расходовании 20 мл титранта ошибка составляет 0,2%. При уменьшении навески и количества титранта точность уменьшается. Таким образом титриметрический анализ позволяет выполнять определение с относительной погрешностью ± (0,2-0,3)%. Каждый из методов имеет свою точность. При анализе важно иметь представление о следующих понятиях:
Грубые ошибки- являются просчетом наблюдателя или нарушения методики анализа. Такие результаты отбрасываются как недостоверные.
Систематические ошибки – отражают правильность результатов анализа. Они искажают результаты измерений, как правило, в одну сторону на некоторое постоянное значение. Систематические ошибки можно частично устранить введением поправок, калибровкой прибора и т.д.
Случайные ошибки – отражают воспроизводимость результатов анализа. Они вызываются неконтролируемыми переменными. Среднее арифметические случайных ошибок стремится к нулю. Поэтому для расчетов необходимо использовать не результаты единичных измерений, а среднее из нескольких параллельных определений.
Абсолютная ошибка –представляет собой разность между полученным результатом и истинным значением. Эта ошибка выражается в тех же единицах, что и определяемая величина.
Относительная ошибка определения равна отношению абсолютной ошибки к истинному значению определяемой величины. Выражают ее обычно в процентах или долях.
Значения относительных ошибок находятся в зависимости от того каким методом выполняют анализ и что из себя представляет анализируемое вещество – индивидуальное вещество и смесь многих компонентов.
Относительная ошибка при исследованиях индивидуальных веществ спектрофотометрическим методом составляет 2-3 %, ИК-спектрофотометрией – 5-12%; жидкостной хроматографией 3-4%; потенциометрией 0,3-1%. Сочетанные методы как правило снижают точность анализа. Наименее точными являются биологические методы – их относительная ошибка достигает 50%.
Методы идентификации лекарственных веществ.
Важнейшим показателем при испытании лекарственных веществ является их идентификация или как это принято в фармакопейных статьях подлинность. Для определения подлинности лекарственных веществ используют многочисленные методы. Все основные и общие описаны в ГФ Х1 издания, вып.1. Исторически основной упор делался на химические, в т.ч. качественные цветные реакции, характеризующие наличие определенных ионов или функциональных групп у органических соединений, одновременно с этим широко использовались и физические методы. В современных фармакопеях упор делается на физико-химические методы.
Остановимся на основных физических методах .
Достаточно стабильной константой, характеризующей вещество, его чистоту и подлинность является температура плавления. Этот показатель широко используется для стандартизации субстанций лекарственных веществ. Подробно методы определения температуры плавления описаны в ГФ Х1, самостоятельно вы смогли опробовать его на лабораторных занятиях. Чистое вещество имеет постоянную температуру плавления, однако при добавлении в него примесей температура плавления как правило снижается весьма существенно. Такой эффект называют пробой смешения и именно проба смешения позволяет устанавливать подлинность препарата при наличии стандартного образца или заведомой пробы. Бывают, правда и исключения, так рацемическая сульфокамфорная кислота плавится при более высокой температуре, а различные кристаллические формы индометацина отличаются температурой плавления. Т.е. данный метод является одним из показателей, позволяющих характеризовать как чистоту продукта, так и его подлинность.
Для некоторых препаратов используют такой показатель как температура затвердевания. Другим показателем, характеризую-щим вещество является температура кипения или температурные пределы перегонки. Этим показателем характеризуют жидкие вещества, например, спирт этиловый. Температура кипения менее характеристичный показатель, он сильно зависит от давления атмосферы, возможности образования смесей или азеотропов и применяется достаточно редко.
Среди других физических методов следует отметить определение плотности, вязкости. Стандартные методики анализа описаны в ГФ Х1. Методом, характеризующим подлинность препарата является также определение растворимости его в различных растворителях. По ГФ Х1 изд. Этот метод характеризуется как свойство, которое может служить ориентировочной характеристикой испытуемого препарата. Наряду с температурой плавления растворимость вещества является одним из параметров, по которому устанавливают подлинность и чистоту практически всех лекарственных веществ. В фармакопее установлена ориентировочная градация веществ по растворимости от очень легко растворим до практически не растворим. При этом растворившимся считается вещество, в растворе которого в проходящем свете не наблюдается частиц вещества.
Физико-химические методы определения подлинности .
Наиболее информативными с точки зрения определения подлинности веществ являются физико-химические методы, основанные на свойствах молекул веществ взаимодействовать с какими-либо физическими факторами. К физико-химическим методам следует отнести:
1.Спектральные методы
УФ-спектроскопия
Спектроскопия в видимом свете
ИК-спектроскопия
Флуоресцентная спектроскопия
Атомно-абсорбционная спектроскопия
Рентгеновские методы анализа
Ядерный магнитный резонанс
Рентгеноструктурный анализ
2.Сорбционные методы анализа
Тонкослойная хроматография
Газожидкостная хроматография
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Элетрофорез
Ионофорез
Гель-хроматография
3.Массовые методы анализа
Масс-спектрометрия
Хроматомассспектрометрия
4.Электрохимические методы анализа
Полярография
Электронный парамагнитный резонанс
5.Использование стандартных образцов
Рассмотрим вкратце применимые в фармации из методов анализа. Подробно все эти методы анализа вам будут прочитаны в конце декабря профессором Мягких В.И. Для определения подлинности лекарственных веществ используют некоторые спектральные методы. Наиболее достоверным является использование низкочастотной области ИК спектроскопии, где полосы поглощения наиболее достоверно отображают данное вещество. Еще эту область называю область отпечатков пальцев. Как правило, для подтверждения подлинности используют сравнение ИК-спектров, снятых в стандартных условиях стандартного образца и испытуемого образца. Совпадение всех полос поглощения подтверждает подлинность препарата. Использование УФ и видимой спектроскопии менее достоверно, т.к. характер спектра не является индивидуальным и отражает только определенный хромофор в структуре органического соединения. Атомно-абсорбционная спектроскопия и рентгеновская спектроскопия используются для анализа неорганических соединений, для идентификации химических элементов. Ядерный магнитный резонанс позволяет устанавливать структуру органических соединений и является достоверным методом подтверждения подлинности, однако в силу сложности приборов и дороговизны используется очень редко и, как правило, только в исследовательских целях. Флуоресцентная спектроскопия применима только для определенного класса веществ, флуоресцирующих под действием УФ излучения. При этом спектр флуоресценции и спектр возбуждения флуоресценции достаточно индивидуальны, но сильно зависят от среды, в которой растворено данное вещество. Этот метод чаще используют для количественного определения, особенно малых количеств, поскольку он является одним из наиболее чувствительных.
Рентгеноструктурный анализ является наиболее достоверным методом подтверждения структуры вещества, он позволяет установить точную химическую структуру вещества, однако для поточного анализа подлинности просто не пригоден и используется исключительно в научных целях.
Сорбционные методы анализа нашли очень широкое применение в фармацевтическом анализе. Они используются для определения подлинности, наличия примесей и количественного определения. Подробно об этих методах и используемой аппаратуре вам будет прочитана лекция профессором В.И.Мягких – региональным представителем фирмы Шимадзу – одного из главных производителей хроматографического оборудования. Эти методы основаны на принципе сорбции-десорбции веществ на определенных носителях в потоке носителя. В зависимости от носителя и сорбента подразделяют на тонкослойную хроматографию, жидкостную колоночную (аналитическую и препаративную, в том числе ВЭЖХ), газожидкостную хроматографию, гель фильтрацию, ионофорез. Два последних метода применяются для анализа сложных белковых объектов. Существенным недостатком методов является их относительность, т.е. хроматография может характеризовать вещество и его количество только при сравнении со стандартным веществом. Однако следует отметить как существенное достоинство – высокая достоверность метода и точность, т.к. в хроматографии любая смесь должна разделиться на индивидуальные вещества и результатом анализа является именно индивидуальное вещество.
Масс-спектрометрические и электрохимические методы используют для подтверждения подлинности редко.
Особое место занимают методы определения подлинности в сравнении со стандартным образцом. Этот метод используют достаточно широко в зарубежных фармакопеях для определения подлинности сложных макромолекул, сложных антибиотиков, некоторых витамином, и других веществ, содержащих особенно хиральные атомы углерода, поскольку определить подлинность оптически активного вещества другими методами сложно или вовсе невозможно. Стандартный образец должен разрабатывать и выпускаться на основании разработанной и утвержденной фармакопейной статьи. В России существуют и применяются всего несколько стандартных образцов и для анализа используют чаще всего так называемые РСО – рабочие стандартные образцы, приготавливаемые непосредственно перед опытом из заведомых субстанций или соответствующих веществ.
Химические методы установления подлинности.
Установление подлинности лекарственных веществ химическими методами используется главным образом для неорганических лекарственных веществ, т.к. иных методов чаще всего нет или они требуют сложной и дорогой аппаратуры. Как уже говорилось неорганические элементы легко идентифицируются методами атомно-абсорбционной или рентгеновской спектроскопии. В наших Фармакопейных статьях обычно используются химические методы установления подлинности. Эти методы принято делить на следующие:
Реакции осаждения анионов и катионов. Типичными примерами являются реакции осаждения ионов натрия и калия с (цинкуранилацетатом и винной кислотой) соответственно:
Таких реакций используется великое множество и они будут подробно обсуждаться в специальном разделе фармацевтической химии в части неорганических веществ.
Окислительно-восстановительные реакции.
Окислительно-восстановительные реакции используют для восстановления металлов из оксидов. Например серебра из его окиси формалинов (реакция серебряного зеркала):
реакция окисления дифениламина лежит в основе испытаний подлинности нитратов и нитритов:
Реакции нейтрализации и разложения анионов.
Карбонаты и гидрокарбонаты под действием минеральных кислот образуют угольную кислоту, которая разлагается до двуокиси углерода:
Аналогично разлагаются нитриты, тиосульфаты, аммониевые соли.
Изменения окраски бесцветного пламени. Соли натрия окрашивают пламя в желтый цвет, меди зеленый, калия в фиолетовый, кальция в кирпично-красный. Именно этот принцип использован в атомно-абсорбционной спектроскопии.
Разложение веществ при пиролизе . Метод используют для препаратов йода, мышьяка, ртути. Из используемых в настоящее время наиболее характерна реакция основного нитрата висмута, который при нагревании разлагается с образованием окислов азота:
Идентификация элементоорганических лекарственных веществ.
Качественный элементный анализ используют для идентификации соединений, содержащих в органической молекуле мышьяк, серу, висмут, ртуть, фосфор, галогены. Поскольку атомы этих элементов не ионизированы для их идентификации используют предварительную минерализацию, либо пиролизом, либо опять-таки пиролизом с серной кислотой. Серу определяют по сероводороду реакцией с нитропруссидом калия или солей свинца. Йод также определяют пиролизом по выделению элементарного йода. Из всех этих реакций интерес представляет идентификация мышьяка, не столько как лекарственного препарата – они практически не используются, а как метод контроля примесей, но об этом позже.
Испытания подлинности органических лекарственных веществ.
Химические реакции, используемые для испытаний подлинности органических лекарственных веществ, можно разделить на три основных группы:
1.Общие химические реакции органических соединений;
2.Реакции образования солей и комплексных соединений;
3.Реакции используемые для идентификации органических оснований и их солей.
Все эти реакции в конечном итоге основаны на принципах функционального анализа, т.е. реакционно-способного центра молекулы, который вступая в реакцию дает соответствующий ответ. Чаще всего это изменение каких-либо свойств вещества: цвета, растворимости, агрегатного состояния и т.д.
Рассмотрим некоторые примеры использования химических реакций для идентификации лекарственных веществ.
1. Реакции нитрования и нитрозирования. Используются достаточно редко, например, для идентификации фенобарбитала, фенацетина, дикаина, правда препараты эти почти не используются в медицинской практике.
2. Реакции диазотирования и азосочетания . Эти реакции используют для открывания первичных аминов. Диазотированный амин сочетается с бэта-нафтолом, давая характерное красное или оранжевое окрашивание.
3. Реакции галогенирования . Используют для открытия алифатических двойных связей – при добавлении бромной воды идет присоединение брома по двойной связи и раствор обесцвечивается. Характерная реакция анилина и фенола – при их обработке бромной водой образуется трибромпроизводное, выпадающее в осадок.
4. Реакции конденсации карбонильных соединений . Реакция заключается в конденсации альдегидов и кетонов с первичными аминами, гидроксиламином, гидразинами и семикарбазидом:
Образующиеся азометины (или Шиффовы основания) имеют характерный желтый цвет. Реакцию используют для идентификации,например сульфониламидов. В качестве альдегида используют 4-диметиламинобензальдегид.
5. Реакции окислительной конденсации . Процесс окислительного расщепления и образования азометинового красителя лежит в основе нингидриновой реакции. Эту реакцию широко используют для открытия и фотоколориметрического определения α- и β-аминокислот, в присутствии которых появляется интенсивная темно-синяя окраска. Она обусловлена образованием замещенной соли дикетогидриндилидендикетогидрамина – продукта конденсации избытка нингидрина и восстановленного нингидрина с аммиаком, выделившимся при окислении испытуемой аминокислоты:
Для открытия фенолов используют реакцию образования триарилметановых красителей. Так фенолы взаимодействуя с формальдегидом образуют красители. К аналогичным реакциям можно отнести взаимодействие резорцина с фталевым ангидридом приводящим к образованию флуоресцентного красителя – флуоресцеина.
Используются также и многие другие реакции.
Особый интерес представляют реакции с образованием солей и комплексов. Неорганические соли железа (III), меди (II), серебра, кобальта, ртути (II) и другие для испытания подлинности органических соединений: карбоновых кислот, в том числе аминокислот, производных барбитуровой кислоты, фенолов, сульфониламидов, некоторых алкалоидов. Образование солей и комплексных соединений происходит по общей схеме:
R-COOH + MX = R-COOM + HX
Аналогично протекает комплексообразование аминов:
R-NH 2 + X = R-NH 2 ·X
Одним из наиболее распространенных реактивов в фармацевтическом анализе является раствор хлорида железа (III). Взаимодействия с фенолами он образует окрашенный раствор феноксидов, они окрашены в синий или фиолетовый цвет. Такая реакция используется для открытия фенола или резорцина. Однако мета-замещенные фенолы не образуют окрашенных соединений (тимол).
Соли меди образуют комплексные соединения с сульфониламидами, соли кобальта с барбитуратами. Многие эти реакции используют и для количественного определения.
Идентификация органических оснований и их солей
. Эта группа методов чаще всего используется в готовых формах, особенно при исследованиях растворов. Так соли органических аминов при добавлении щелочей образуют осадок основания (например, раствор папаверина гидрохлорида) и наоборот соли органических кислот при добавлении минеральной кислоты дают осадок органического соединения (например, салицилат натрия). Для идентификации органических оснований и их солей широко используют так называемые осадительные реактивы. Известно более 200 осадительных реактивов, которые образуют с органическими соединениями нерастворимые в воде простые или комплексные соли. Наиболее употребительные растворы приводятся во втором томе ГФ 11 издания. В качестве примера можно привести:
Реактив Шейблера – фосфорновольфрамовая кислота;
Пикриновая кислота
Стифниновая кислота
Пикраминовая кислота
Все эти реактивы используются для осаждения органических оснований (к примеру, нитроксолин).
Следует отметить, что все эти химические реакции используются для идентификации лекарственных веществ не сами по себе, а в комплексе с другими методами, чаще всего физико-химическими, такими как хроматография, спектроскопия. Вообще необходимо обратить внимание, что проблема подлинности лекарственных веществ является ключевой, т.к. этот факт определяет безвредность, безопасность и эффективность лекарственного средства, поэтому такому показателю необходимо уделять большое внимание и подтвердить подлинность вещества одним методом недостаточно.
Общие требования к испытаниям на чистоту.
Другим не менее важным показателем качества лекарственного средства является чистота. Все лекарственные препараты, независимо от способа их получения испытывают на чистоту. При этом устанавливается содержание примесей в препарате. Условно можно разделить примеси на две группы: первая, примеси, оказывающие фармакологическое действие на организм; вторая, примеси, указывающие на степень очистки вещества. Последние не влияют на качество препарата, но в больших количествах снижают его дозу и соответственно уменьшают активность препарата. Поэтому все фармакопеи устанавливают определенные пределы этих примесей в лекарственных препаратах. Таким образом, основной критерий доброкачественности препарата – отсутствие примесей, что невозможно по природе. Понятие отсутствие примесей связано с пределом обнаружения тем или иным методов.
Физические и химические свойства веществ и их растворов дают ориентировочное представление о наличии примесей в лекарственных препаратах и регламентируют их пригодность для использования. Поэтому, чтобы оценить доброкачественность, наряду с установлением подлинности и определением количественного содержания, проводят целый ряд физических и химических испытаний, подтверждающих степень его чистоты:
Прозрачность и степень мутности проводится путем сравнения с эталоном мутности, а прозрачность определяется путем сравнения с растворителем.
Цветность.
Изменение степени цветности может быть обусловлено:
а) наличием посторонней окрашенной примеси;
б) химическим изменением самого вещества (окисление, взаимодействие с Ме +3 и +2 или другие химические процессы, протекающие с образованием окрашенных продуктов. Например:
Резорцин желтеет при хранении за счет окисления под действием кислорода воздуха с образованием хинонов. При наличии, например, солей железа салициловая кислота приобретает фиолетовый цвет вследствие образования салицилатов железа.
Оценка цветности проводится по результатам сравнения основного опыта с эталонами цветности, а бесцветность определяют путем сравнения с растворителем.
Очень часто используют для обнаружения примесей органических веществ испытание, основанное на их взаимодействии с концентрированной серной кислотой, которая при этом может выступать в роли окислителя или дегидратирующего средства. В результате таких реакций образуются окрашенные продукты, Интенсивность полученной окраски не должна превышать соответствующего эталона цветности.
Определение степени белизны порошкообразных лекарственных средств – физический метод, впервые включенный в ГФ Х1. Степень белизны (оттенка) твердых лекарственных веществ можно оценивать различными инструментальными методами на основе спектральной характеристики света отраженного от образца. Для этого применяют коэффициенты отражения при освещении образца белым светом, полученным от специального источника, со спектральным распределением или пропущенным через светофильтры (с мах пропускания 614 нм (красный) или 439 нм (синий)). Можно также измерять коэффициент отражения света, пропущенного через зеленый светофильтр.
Более точно оценку белизны лекарственных веществ можно осуществлять с помощью спектрофотометров отражения. Значение степени белизны и степени яркости являются характеристиками качества белых и белых с оттенками лекарственных веществ. Их допустимые пределы регламентируются в частных статьях.
Определение кислотности, щелочности, рН.
Изменение этих показателей обусловлено:
а) изменением химической структуры самого лекарственного вещества:
б) взаимодействием препарата с тарой, например, превышение допустимых пределов щелочности в растворе новокаина за счет выщелачивания стекла;
в) поглощнием газообразных продуктов (СО 2 , NН 3) из атмосферы.
Определение качества лекарственных средств по этим показателям осуществляется несколькими способами:
а) по изменению окраски индикатора, например, примесь минеральных кислот в кислоте борной определяется по метиловому красному, который не изменяет своей окраски от действия слабой борной кислоты, но розовеет в случае наличия в ней примесей минеральных кислот.
б) титриметрический метод – например, для установления допустимого предела содержания йодоводородной кислоты, образующейся при хранении 10% спиртового раствора I 2 , проводят титрование щелочью (не более 0,3 мл 0,1 моль/л NаОН по объему титранта). (Раствор формальдегида – титруют щелочью в присутствии фенолфталеина).
В ряде случаев ГФ устанавливает объем титранта для определения кислотности или щелочности.
Иногда проводят последовательное прибавление двух титрованных растворов: вначале кислоты и затем щелочи.
в) путем определения значения величины рН – для ряда лекарственных средств (и обязательно для всех инъекционных растворов) по НТД предусматривается определять величины рН.
Приемы подготовки вещества при исследовании кислотности, щелочности, рН
- Приготовление раствора определенной концентрации, указанной в НТД (для веществ, растворимых в воде)
- Для нерастворимых в воде – готовят взвесь определенной концентрации и определяют кислотно-щелочные свойства фильтрата.
- Для жидких препаратов, не смешивающихся с водой, проводят взбалтывание с водой, затем отделяют водный слой и определяют его кислотно-щелочные свойства.
- Для нерастворимых твердых и жидких веществ определение можно проводить непосредственно во взвеси (ZnO)
Значение рН ориентировочно (до 0,3 ед) можно определять с помощью индикаторной бумаги или универсального индикатора.
Колориметрический способ основан на свойстве индикаторов изменять свою окраску при определенных интервалах значений рН среды. Для выполнения испытаний используют буферные растворы с постоянной концентрацией водородных ионов, отличающихся друг от друга на величину рН, равную 0,2 . К серии таких растворов и к испытуемому раствору прибавляют одинаковое количество (2-3 капли) индикатора. По совпадению окраски с одним из буферных растворов судят о значении рН среды испытуемого раствора.
Определение летучих веществ и воды.
Летучие вещества могут попасть в лекарственные средства либо вследствие плохой очистки от растворителей или промежуточных продуктов получения, либо в результате накопления продуктов разложения. Вода в лекарственном веществе может содержаться в виде капиллярной, абсорбировано связанной, химически связанной (гидратно- и кристаллогидратной) или свободной.
Для определения летучих веществ и воды используют методы высушивания, дистилляции и титрование раствором Фишера.
Метод высушивания. Метод применяют для определения потери в массе при высушивании. Потери могут быть за счет содержания в веществе гигроскопической влаги и летучих веществ. Сушат в бюксе до постоянной массы при определенной температуре. Чаще вещество выдерживают при температуре 100-105 ºС, но условия высушивания и доведения до постоянной массы могут быть и иными.
Определение летучих веществ может проводиться для некоторых средств методом прокаливания. Вещество нагревают в тигле до полного удаления летучих веществ. затем постепенно повышают температуру до полного прокаливания при красном калении. Например, ГФХ регламентирует определение примеси карбоната натрия в лекарственном веществе натрия гидрокарбонат методом прокаливания. Натрия гидрокарбонат разлагается при этом на карбонат натрия, диоксид углерода и воду:
Теоретически потеря в массе составляет 36,9 %. По ГФХ потеря в массе должна быть не менее 36,6%. Разница между теоретической и указанной в ГФХ потерей в массе определяет допустимый предел примеси карбоната натрия в веществе.
Метод дистилляции в ГФ 11 называется «Определение воды», он позволяет определить воду гигроскопическую. Этот метод основан на физическом свойстве паров двух несмешивающихся жидкостей. Смесь воды с органическим растворителем перегоняется при более низкой температуре, чем каждая из этих жидкостей. В качестве органического растворителя ГФХ1 рекомендует использовать толуол или ксилол. Содержание воды в испытуемом веществе устанавливают по объему ее в приемнике после окончания процесса перегонки.
Титрование реактивом Фишера. Метод позволяет определять суммарное содержание как свободной, так и кристаллогидратной воды в органических, неорганических веществах, растворителях. Преимущество этого метода – быстрота выполнения и селективность по отношению к воде. Раствор Фишера представляет собой раствор диоксида серы, йода и пиридина в метаноле. К числу недостатков метода, помимо необходимости строгого соблюдения герметичности, относится невозможность определения воды в присутствии веществ, которые реагируют с компонентами реактива.
Определение золы.
Зольность обусловлена минеральными примесями, которые появляются в органических веществах в процессе получения из исходных продуктов вспомогательных материалов и аппаратуры (прежде всего катионов металлов), т.е. характеризует наличие неорганических примесей в органических веществах.
а) Общая зола – определяется по результатам сжигания (озоления, минерализации) при высокой температуре, характеризует сумму всех неорганических веществ-примесей.
Состав золы:
Карбонаты: СаСО 3 , Nа 2 СО 3 , К 2 СО 3 , РbСО 3
Оксиды: CaO, PbO
Сульфаты: CaSO 4
Хлориды: CaCl 2
Нитраты: NaNO 3
При получении лекарственных средств из растительного сырья минеральные примеси могут быть обусловлены загрязнениями растений пылью, поглощением микроэлементов и неорганических соединений из почвы, воды и т.д.
б) Зола, нерастворимая в хлороводородной кислоте , получают после обработки общей золы разбавленной НСl. Химический состав золы – хлориды тяжелых металлов (АgCl, НgСl 2 , Нg 2 Сl 2), т.е. высокотоксичные примеси.
в) Сульфатная зола – Сульфатную золу определяют при оценке доброкачественности многих органических веществ. Характеризует примеси Мn +n в стабильной сульфатной форме. Образовавшаяся сульфатная зола (Fе 3 (SО 4) 2 , РbSО 4 , СаSО 4) используется для последующего определения примеси тяжелых металлов.
Примеси неорганических ионов – С1 – , SО 4 -2 , NН 4 + , Са +2 , Fе +3(+2) , Рв +2 , Аs +3(+5)
Недопустимые примеси
:
а) примеси, имеющие токсический характер (примесь СN – в йоде),
б) обладающие антагонистическим действием (Nа и К, Мg и Са)
Отсутствие примесей, не допускаемых в лекарственном веществе, устанавливают по отрицательной реакции с соответствующими реактивами. Сравнение в этом случае проводится с частью раствора, к которому добавлены все реактивы, кроме основного открывающего данную примесь (контрольный опыт). Положительная реакция говорит о наличии примеси и о недоброкачественности лекарственного средства.
Допустимые примеси – примеси, не оказывающие влияния на фармакологический эффект и содержание которых допускается в незначительных количествах, установленных НТД.
Для установления допустимого предела содержания примесей ионов в лекарственных средствах используются эталонные растворы, которые содержат соответствующий ион в определенной концентрации.
Некоторые лекарственные вещества испытывают на наличие примеси методом титрования, например, определение примеси норсульфазола в лекарственном средстве фталазол. Примесь норсульфазола во фталазоле устанавливают количественно нитритометрически. На титрование 1 г фталазола должно расходоваться не более 0,2 мл 0,1 моль/л NaNО 2 .
Общие требования к реакциям, которые используются при испытаниях на допустимые и недопустимые примеси:
1. чувствительность,
2. специфичность,
3. воспроизводимость используемой реакции.
Результаты реакций, протекающих с образованием цветных продуктов, наблюдают в отраженном свете на матовобелом фоне, а белые осадки в виде мути и опалесценции – в проходящем свете на черном фоне.
Приборные методы определения примесей.
С развитием методов анализа постоянно повышаются требования к чистоте лекарственных веществ и лекарственных форм. В современных фармакопеях наряду с рассмотренными методами используются и различные приборные методы, основанные на физико-химических, химических и физических свойствах веществ. Использование УФ и видимой спектроскопии редко дает положительные результаты и обусловлено это тем, что строение примесей, особенно органических лекарств, как правило. Близко к строению и самого лекарства, поэтому спектры поглощения различаются мало, а концентрация примеси обычно в десятки раз ниже, чем основного вещества, что делает дифференциальные методы анализа малопригодными и позволяет оценить примесь только ориентировочно, т.е как принято называть полуколичественно. Несколько лучше бывают результаты, если одно из веществ, особенно, примесь образует комплексное соединение, а другое нет, тогда максимумы спектров существенно различаются и уже можно определять примеси количественно.
В последние годы на предприятиях появились приборы ИК-Фурье, позволяющие определять как содержание основного вещества, так и примесей, особенно воды без разрушения образца, однако их применение сдерживается дороговизной приборов и отсутствием стандартизированных методик анализа.
Отличные результаты определения примесей возможны тогда, когда примесь флуоресцирует под действием УФ излучение. Точность таких анализов очень высока, также как и их чувствительность.
Широкое применение для испытаний на чистоту и количественное определение примесей как в лекарственных вещества (субстанциях), так и в лекарственных формах, что, пожалуй, не менее важно, т.к. многие примеси образуются в процессе хранения лекарств, получили хроматографические методы: ВЭЖХ, ТСХ, ГЖХ.
Эти методы позволяют определять примеси количественно, причем каждую из примесей индивидуально в отличие от других методов. Подробно методы хроматографии ВЭЖХ и ГЖХ будут рассмотрены в лекции проф. Мягких В.И. Мы остановимся только на тонкослойной хроматографии. Метод тонкослойной хроматографии был открыт русским ученым Цветом и в начале существовал как хроматография на бумаге. Тонкослойная хроматография (ТСХ) основана на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой смеси в плоском тонком слое сорбента при движении по нему растворителя (элюента). Сорбентами служат силикагель, окись алюминия, целлюлоза. Полиамид, элюентами – органические растворители разной полярности или их смеси между собой и иногда с растворами кислот или щелочей и солей. Механизм разделения обусловлен коэффициентами распределения между сорбентом и жидкой фазой исследуемого вещества, что в свою очередь связано со многими, в том числе химическими и физико-химическими свойствами веществ.
В ТСХ поверхность пластинки алюминиевой или стеклянной покрывают суспензией сорбента, высушивают на воздухе и активируют для удаления следов растворителя (влаги). В практике используют обычно пластины промышленного изготовления с закрепленным слоем сорбента. На слой сорбента наносят капли анализируемого раствора объемом 1-10 мкл. Край пластины погружают в растворитель. Эксперимент проводят в специальной камере – стеклянном сосуде, закрытом крышкой. Растворитель перемещается по слою под действием капиллярных сил. Возможно одновременное разделение нескольких различных смесей. Для увеличения эффективности разделения используют многократное элюирование или в перпендикулярном направлении тем же или другим элюентом.
После завершения процесса пластинку высушивают на воздухе и устанавливают положение хроматографических зон компонентов различными способами, например, облучением УФ-излучением, опрыскиванием окрашивающими реагентами, выдерживают в парах йода. На полученной картине распределения (хроматограмме) хроматографические зоны компонентов смеси располагаются в виде пятен в соответствии с их сорбируемостью в данной системе.
Положение хроматографических зон на хроматограмме характеризуют величиной R f . которая равна отношению пути l i , пройденному і-тым компонентом от точки старта, к пути Vп R f = l i / l.
Величина R f зависит от коэффициента распределения (адсорбции) К і и соотношения объемов подвижной (V п) и неподвижной (V н) фаз.
На разделение в ТСХ влияет ряд факторов – состав и свойства элюента, природа, дисперсность и пористость сорбента, температура, влажность, размеры и толщина слоя сорбента и размеры камеры. Стандартизация условий эксперимента позволяет устанавливать R f с относительным стандартным отклонением 0,03.
Идентификацию компонентов смеси проводят по величинам R f . Количественное определение веществ в зонах можно осуществлять непосредственно на слое сорбента по площади хроматографической зоны, интенсивности флуоресценции компонента или его соединения с подходящим реагентом, радиохимическими методами. Используют также автоматические сканирующие приборы, измеряющие поглощение, пропускание, отражение света или радиоактивность хроматографических зон. Разделенные зоны можно снять с пластины вместе со слоем сорбента, десорбировать компонент в растворитель и анализировать раствор спектрофотометрически. С помощью ТСХ можно определить вещества в количествах от 10 -9 до 10 -6 ; ошибка определения не менее 5-10%.
К ним относятся: определение температур плавления и затвердевания, а также температурных пределов перегонки; определение плотности, показателей преломления (рефрактометрия), оптического вращения (поляриметрия); спектрофотометрия -- ультрафиолетовая, инфракрасная; фотоколориметрия, эмиссионная и атомно-абсорбционная спектрометрия, флуориметрия, спектроскопия ядерного магнитного резонанса, масс-спектрометрия; хроматография -- адсорбционная, распределительная, ионообменная, газовая, высокоэффективная жидкостная; электрофорез (фронтальный, зональный, капиллярный); электрометрические методы (потенциометрическое определение рН, потенциометрическое титрование, амперометрическое титрование, вольтамперометрия).
Кроме того, возможно применение методов, альтернативных фармакопейным, которые иногда имеют более совершенные аналитические характеристики (скорость, точность анализа, автоматизация). В некоторых случаях фармацевтическое предприятие приобретает прибор, в основе использования которого лежит метод, еще не включенный в Фармакопею (например, метод романовской спектроскопии -- оптический дихроизм). Иногда целесообразно при определении подлинности или испытании на чистоту заменить хроматографическую методику на спектрофотометрическую. Фармакопейный метод определения примесей тяжелых металлов осаждением их в виде сульфидов или тиоацетамидов обладает рядом недостатков. Для определения примесей тяжелых металлов многие производители внедряют такие физико-химические методы анализа, как атомно-абсорбционная спектрометрия и атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой.
В некоторых частных статьях ГФ X рекомендуется определять температуру затвердевания или температуру кипения (по ГФ XI -- «температурные пределы перегонки») для ряда жидких ЛC. Температура кипения должна укладываться в интервал, приведенный в частной статье. Более широкий интервал свидетельствует о присутствии примесей.
Во многих частных статьях ГФ X приведены допустимые значения плотности, реже вязкости, подтверждающие подлинность и доброкачественность ЛC.
Практически все частные статьи ГФ X нормируют такой показатель качества ЛC, как растворимость в различных растворителях. Присутствие примесей в ЛB может повлиять на его растворимость, снижая или повышая ее в зависимости от природы примеси.
Физические методы анализа
Подлинность лекарственного вещества подтверждают; агрегатное состояние (твердое вещество, жидкость, газ); окраска, запах; форма кристаллов или вид аморфного вещества; гигроскопичность или степень выветриваемости на воздухе; устойчивость к воздействию света, кислорода воздуха; летучесть, подвижность, воспламеняемость (жидкостей). Окраска лекарственного вещества -- одно из характерных свойств, позволяющее осуществить его предварительную идентификацию.
Степень белизны (оттенка) твердых лекарственных веществ можно оценить различными инструментальными методами на основе спектральной характеристики света, отраженного от образца. Для этого измеряют коэффициенты отражения при освещении образца белым светом. Коэффициент отражения -- это отношение величины отраженного светового потока к величине падающего светового потока. Он позволяет определить наличие или отсутствие у лекарственных веществ цветового оттенка по степени белизны и степени яркости. Для белых или белых с сероватым оттенком веществ степени белизны теоретически равна 1. Вещества, у которых она 0,95--1,00, а степени яркости < 0,85, имеют сероватый оттенок.
Более объективным является установление различных физических констант: температуры плавления (разложения), температуры кипения, плотности, вязкости. Важный показатель подлинности -- растворимость лекарственного препарата в воде, растворах кислот, щелочей, органических растворителях (эфире, хлороформе, ацетоне, бензоле, этиловом и метиловом спирте, маслах и др.).
Константой, характеризующей гомогенность твердых веществ, является температура плавления. Ее используют в фармацевтическом анализе для установления подлинности и чистоты большинства твердых лекарственных веществ. Известно, что это температура, при которой твердое тело находится в равновесии с жидкой фазой при насыщенной фазе пара. Температура плавления является постоянной величиной для индивидуального вещества. Присутствие даже небольшого содержания примесей изменяет (как правило, снижает) температуру плавления вещества, что позволяет судить о степени его чистоты. Под температурой плавления подразумевается интервал температур, при котором происходит процесс плавления испытуемого препарата от появления первых капель жидкости до полного перехода вещества в жидкое состояние. Некоторые органические соединения при нагревании разлагаются. Процесс этот происходит при температуре разложения и зависит от ряда факторов, в частности от скорости нагрева. Приведенные интервалы температур плавления указывают на то, что между началом и окончанием плавления лекарственного вещества интервал не должен превышать 2°С. Если переход вещества из твердого в жидкое состояние нечеткий, то вместо интервала температуры плавления устанавливают температуру, при которой происходит только начало или только окончание плавления. Следует учитывать, что на точность установления температурного интервала, при котором происходит плавление испытуемого вещества, могут влиять условия подготовки образца, скорость подъема и точность измерения температуры, опытность аналитика.
Температура кипения -- это интервал между начальной и конечной температурой кипения при нормальном давлении 760 мм рт.ст. (101,3 кПа). Температуру, при которой в приемник перегнались первые 5 капель жидкости, называют начальной температурой кипения, а температуру, при которой перешло в приемник 95% жидкости, -- конечной температурой кипения. Указанные пределы температур можно установить макрометодом и микрометодом. Следует учитывать, что температура кипения зависит от атмосферного давления. Температуру кипения устанавливают только у сравнительно небольшого числа жидких лекарственных препаратов: циклопропана, хлорэтила, эфира, фторотана, хлороформа, трихлорэтилена, этанола.
При установлении плотности берут массу вещества определенного объема. Плотность устанавливают с помощью пикнометра или ареометра, строго соблюдая температурный режим, так как плотность зависит от температуры. Обычно это достигается термостатированием пикнометра при 20°С. Определенные интервалы значений плотности подтверждают подлинность этилового спирта, глицерина, масла вазелинового, вазелина, парафина твердого, галогенопроизводных углеводородов (хлорэтила, фторотана, хлороформа), раствора формальдегида, эфира для наркоза, амилнитрита и др.
Вязкость (внутреннее трение) -- физическая константа, подтверждающая подлинность жидких лекарственных веществ. Различают динамическую (абсолютную), кинематическую, относительную, удельную, приведенную и характеристическую вязкость. Каждая из них имеет свои единицы измерения.
Для оценки качества жидких препаратов, имеющих вязкую консистенцию, например глицерина, вазелина, масел, обычно определяют относительную вязкость. Она представляет собой отношение вязкости исследуемой жидкости к вязкости воды, принятой за единицу.
Растворимость рассматривают не как физическую константу, а как свойство, которое может служить ориентировочной характеристикой испытуемого препарата. Наряду с температурой плавления растворимость вещества при постоянной температуре и давлении является одним из параметров, по которому устанавливают подлинность и чистоту практически всех лекарственных веществ.
Методика определения растворимости основана на том, что навеска предварительно растертого (в необходимых случаях) препарата вносится в отмеренный объем растворителя и непрерывно перемешивается в течение 10 мин при (20±2)°С. Растворившимся считают препарат, в растворе которого в проходящем свете не наблюдается частиц вещества. Если для растворения препарата требуется более 10 мин, то его относят к числу медленно растворимых. Их смесь с растворителем нагревают на водяной бане до 30° С и наблюдают полноту растворения после охлаждения до (20±2)°С и энергичного встряхивания в течение 1--2 мин.
Метод фазовой растворимости дает возможность осуществлять количественную оценку степени чистоты лекарственного вещества путем точных измерений значений растворимости. Суть установления фазовой растворимости заключается в последовательном прибавлении увеличивающейся массы препарата к постоянному объему растворителя. Для достижения состояния равновесия смесь подвергают длительному встряхиванию при постоянной температуре, а затем с помощью диаграмм определяют содержание растворенного лекарственного вещества, т.е. устанавливают, является ли испытуемый препарат индивидуальным веществом или смесью. Метод фазовой растворимости отличается объективностью, не требует для выполнения дорогостоящего оборудования, знания природы и структуры примесей. Это позволяет использовать его для качественного и количественного анализов, а также для изучения стабильности и получения очищенных образцов препаратов (до степени чистоты 99,5%), Важное достоинство метода -- возможность отличать оптические изомеры и полиморфные формы лекарственных веществ. Метод применим ко всем видам соединений, которые образуют истинные растворы.
Физико-химические методы
Приобретают все большее значение для целей объективной идентификации и количественного определения лекарственных веществ. Получивший распространение в различных отраслях недеструктивный анализ (без разрушения анализируемого объекта) играет важную роль и в фармацевтическом анализе. Для его выполнения пригодны многие физико-химические методы, в частности оптические, ЯМР-, ПМР-, УФ- и ИК- спектроскопия и др.
В фармацевтическом анализе наиболее широко используют физико-химические методы, которые могут быть классифицированы на следующие группы: оптические методы; методы, основанные на поглощении излучения; методы, основанные на испускании излучения; методы, основанные на использовании магнитного поля; электрохимические методы; методы разделения; термические методы.
Большинство перечисленных методов (за исключением оптических, электрохимических и термических) широко применяют для установления химической структуры органических соединений.
Физико-химические методы анализа имеют ряд преимуществ перед классическими химическими методами. Они основаны на использовании как физических, так и химических свойств веществ и в большинстве случаев отличаются экспрессностью, избирательностью, высокой чувствительностью, возможностью унификации и автоматизации.